醫療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照材料Biologicalevaluationofmedicaldevice2023-11-27發布2023-11-27發布國家市場監督管理總局發布國家標準化管理委員會前言 I 2規范性引用文件 13術語和定義 4通用要求 35.1總體要求 5.2生物安全性試驗用RM的認證 36RM作為試驗對照的應用 47試驗樣品選擇 48試驗樣品與RM制備 49器械代表性部分的選擇 510樣品浸提液制備 10.1總體要求 510.2浸提容器 10.3浸提條件和方法 510.4原位聚合材料的浸提條件 811記錄 8附錄A(資料性)試驗對照 附錄B(資料性)試驗樣品制備和樣品選擇的基本原則與規范 附錄C(資料性)試驗樣品浸提原則 附錄D(資料性)聚合材料生物學評價的極限浸提 參考文獻 Ia)更改了“范圍”,僅涵蓋生物學評價試驗的浸提(見第1章，2017年版的第1章);和3.10);c)更改了浸提條件列項(見10.3.1,2017年版的10.3.1)。本文件由全國醫療器械生物學評價標準化技術委員會(SACⅡ——2000年首次發布為GB/T16886.12—2000,2005年第一次修訂，2017年第二次修訂；Ⅲ樣品制備方法同時適用于生物學評價方法和被評價的材料，這是重要的。每——第1部分：風險管理過程中的評價與試驗。目的是保護人類免于因使用醫療器械所產生的潛——第2部分：動物福利要求。目的是最大限度利用科學合理的非動物試驗，確保用于評價醫療 第4部分：與血液相互作用試驗選擇。目的是為醫療器械與血液相互作用評價提供通用——第5部分：體外細胞毒性試驗。目的是為評估醫療器械體外細胞毒性提供試驗方法。——第6部分：植入后局部反應試驗。目的是為評估醫療器械所用生物材料植入后局部反應提供——第7部分：環氧乙烷滅菌殘留量。目的是為經環氧乙烷(EO)滅菌的單件醫療器械上EO及——第9部分：潛在降解產物的定性和定量框架。目的是為系統評價醫療器械潛在的和已觀察到——第10部分：刺激與皮膚致敏試驗。目的是為醫療器械及其組成材料潛在刺激和皮膚致敏提——第11部分：全身毒性試驗。目的是為評價醫療器械材料導致潛在不良全身反應時提供試驗——第12部分：樣品制備與參照材料。目的是為醫療器械生物學評價中樣品制備方法和參照材 ——第16部分：降解產物與可瀝濾物毒代動力學研究設計。目的是提供與醫療——第17部分：可瀝濾物允許限量的建立。目的是為醫療器械可瀝濾物允許限量的建立提供——第20部分：醫療器械免疫毒理學試驗原則和方法。目的是為醫療器械潛在1醫療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照材料1范圍本文件規定了醫療器械在主要按照ISO10993(所有部分)的一個或多個部分規定的生物學系統進行試驗時所要遵循的樣品制備和參照材料選擇的要求，并給出程序指南。本文件適用于：——試驗樣品選擇；——醫療器械上代表性部分的選取；——試驗樣品制備；——試驗對照；——參照材料的選擇和要求；——浸提液制備。本文件不適用于活體細胞，但能適用于含活細胞的組合產品中的材料或醫療器械組分。用于化學表征的浸提見ISO10993-18。本文件第7章、第8章、第9章、第10章[10.3.5和10.3.11b)除外]和第11章適用于進行化學表征的浸提，附錄C中C.1～C.4給出的信息也可能是相關的。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。ISO和IEC維護的用于標準化的術語數據庫，地址如下：不含試驗材料的浸提介質，其在浸提過程中置于與試驗樣品同樣的容器中并采用同樣的浸提條件。有證標準樣品certifiedreferencematerial;CRM采用計量學上有效程序測定的一種或多種規定特性的參照材料(RM),并附有證書提供規定特性值及其不確定度和計量溯源性的陳述。2加嚴浸提exaggeratedextraction與臨床使用條件下相比，預期會導致更多或更大量化學成分釋放的浸提。進行多步驟浸提，直到在后續浸提步驟中通過重量分析法(或通過其他方法實現)測得的浸提物質的量小于首次浸提測得量的10%的浸提。具有明確反應特性的物質，用于特定的試驗系統以評價試驗系統的反應是否具有重現性和適宜性。由試驗樣品或對照樣品浸提而得的液體。可浸提物extractablesubstance某一醫療器械或材料用浸提溶劑和/或在至少與預期臨床使用相同或更嚴格的條件下浸提時，能釋放出的物質。材料的化學和物理組成的一致性，以及對生物學終點反應的均勻性。可瀝濾物leachablesubstance臨床使用過程中從醫療器械或材料釋放的物質。經充分表征的材料和/或物質，當用特定試驗方法評估時，顯示該試驗系統適宜產生可重復的、適當經充分表征的材料和/或物質，當用特定試驗方法評估時，顯示該試驗系統適宜產生可重復的、適當具有一種或多種規定特性足夠均勻且穩定，并已確定其符合測量過程的預期用途的材料。3當材料在規定條件下貯存時，在特定時間段內保持特定屬性值在規定限度內的特性。試驗樣品testsample用于生物學評價試驗的醫療器械、組件或材料(或用相同方法生產和加工的具有代表性的樣品)、或浸提液或其中部分。4通用要求識別醫療器械相關的危險(源)并估計風險時，需在試驗設計和樣品制備中考慮加工過程的變化或對加工過程控制不充分引起的危險(源),如ISO14971中所述。應特別注意材料添加劑，非預期的基礎材料雜質以及加工過程中的殘留物，如微量元素、清洗和消毒劑。ISO10993(所有部分)中描述了許多不同的生物學試驗系統。因此，應按照各部分具體的標準以確保所推薦的方法是否適用于特定的試驗系統。在生物學評價中，應使用試驗對照來確認試驗程序或進行材料間試驗結果比對，或以上兩種方式。應根據特定試驗的規定，使用陰性對照、空白或陽性對照，或以上3種。RM由各自的實驗室來建立。其化學、物理學和生物學表征的程度由各自的實驗室確定。可用市售商品作RM。選擇純度高、經關鍵性表征、符合預期用途且易得的材料作為CRM。其關鍵的化學、物理和生物學表征應經3個或3個以上實驗室的協作標定來確定，再由銷售商提供給研究人員。使用者最好能得到RM或CRM供應商的承諾，聲明這些材料至少在5年內有供應。其次但不太理想的選擇是使原始RM或CRM公布“公開配方”,即公布源材料和詳細的加工過程，以確保RM批次間的均一性。5.2生物安全性試驗用RM的認證RM認定是在規定的試驗條件下，為材料的生物學反應賦值(數值或量值)的程序，以確保其在實驗4室內或實驗室之間(或以上兩種情況)反應具有再現性。與該材料有關的生物學反應范圍應通過實驗室試驗來確定。RM供應商應對材料進行認證。供應商確定對其進行化學和物理學表征的程度。使用RM的各實驗室應識別RM所需的生物學表征，以使RM符合特定試驗或程序的要求。市場上可買到的材料可用作RM,前提是它們經過認證和認定。RM認證是在規定的試驗條件下，為材料的生物學反應賦值(數值或量值)的程序。這一過程以出具證書的形式對該材料的特定反應的試驗和結果加以確認。應通過實驗室間的試驗來確定材料的生物學反應。6RM作為試驗對照的應用RM或CRM應作為對照材料用于生物學試驗，以出現重現性反應(即陽性或陰性，或以上兩種反應)來證實試驗程序的適用性。用于這種用途的任何材料在每一預期使用的生物學試驗程序中均應進行表征。一種經表征并認證適用于某種參照試驗方法或反應(如遲發型超敏試驗)的材料不應在未經確認前用作其他試驗(如細胞毒性試驗)的RM。用作試驗對照的RM應符合制造商和檢測實驗室所建立的質量保證程序。RM應根據來源、制造商、等級和類型進行識別。按照第8章制備RM。RM用作試驗對照時其材料類別應與試驗樣品相同，即聚合物、陶瓷、金屬和膠體等。但是，純品可用作基于機理研究的試驗程序的試驗對照，如遺傳毒性和免疫遲發型超敏反應。7試驗樣品選擇應對最終產品、取自最終產品中有代表性的樣品或與最終產品以相同的工藝過程制得的材料(見ISO10993-1),或者制備的其中任何一種適合的浸提液進行測試。試驗樣品的選擇應予以論證。對于具有潛在的毒性降解物和殘留物的可吸收材料，宜考慮對中間產物進行測試。當需要用浸提液進行試驗時，采用相同的試驗樣品選擇程序。8試驗樣品與RM制備制備試驗樣品與RM時應謹防污染。來自制造過程的任何殘留物、有意或無意的添加劑或污染物均應視為醫療器械、醫療器械部件/組件或代表性樣品的構成部分。——如對試驗程序適用，對取自滅菌醫療器械的試驗樣品和RM,應采取無菌操作。——如對試驗程序適用，清潔、無菌和已消毒的試驗樣品應按照制造商推薦的方法處理，并采取無——在試驗樣品選擇和制備時應考慮清洗過程和清洗劑的影響。對于取自不需要無菌使用器械的試驗樣品，應按供應狀態使用并在試驗樣品制備過程中采用無菌操作。如果某一試驗程序(如細胞毒性試驗)需要無菌試驗樣品，應考慮滅菌或再滅菌過程對試驗樣品5試驗樣品和RM需要分割成如10.3.3中描述的小塊時，應考慮原先沒有暴露的表面(如內腔或切面)的影響。將醫療器械切割成試驗用的有代表性部分的工具，使用時應被清潔以免導致污染。此10.3.1浸提條件建立在通常可行并經論證為一個標準化方法的基礎之上，在多數情的適當加嚴的條件。應在下列之一的條件下進行浸提(見C.5):6短期接觸的醫療器械細胞毒性試驗中，浸提條件可選擇(37±1)℃下浸提(24±2)h。對于短期接觸完好皮膚或黏膜的非植入類醫療器械，細胞毒性試驗中的浸提時間可選擇少于24h,但不少于4h(見ISO10993-5)。對于長期(>24h～30d)或持久接觸(>30d)的醫療器械，細胞毒性試驗中的浸提時間建議為72h,因為浸提24h獲得的浸提物可能不足以代表器械使用24h后釋放的化學物。在這時間延長至72h不會導致其他化學物質從器械中釋放，則浸提24h就足夠了。對于含血清的組織培(T)決定了聚合物鏈的遷移率和相中的擴散速率。通常，在高于T。的溫度下，與低于T。的溫度相的組成材料的熱性質(例如聚合物的T)以及相關的臨床使用條件。對于這些材料，基浸提液的滲透壓或pH可能會發生變化，并且可能不適用于待測的試驗系統。在生物相容性試驗之前以解釋基于細胞的體外試驗的不合格數據)。有關在這些試驗條件下無法評價的潛在中間降解物的化體積。見表1。如果能模擬臨床使用過程的條件或提供對潛在危險的測定，則能使用其他表面積/體積浸提比除非有其他不適用性(見10.3.4),浸提之前可將材料切成小塊，以使材料浸沒在浸提介質中。例7表1標準表面積和浸提液體積浸提比例(表面積或質量/體積)±10%材料形態舉例(低密度材料)注：雖然目前沒有可用于測試對溶劑有吸收的聚合物材料(例如吸收劑和水膠體)的標準化方——測定每0.1g或1.0cm2的材料吸收浸提介質的體積；——然后，在進行材料浸提時，對浸提混合物按每0.1g或1.0cm2額外加入該浸提介質的吸收體積。‘如果醫療器械包括多個具有不同厚度的與組織接觸組件，則浸提比例宜論證。其中一種方法是基于該組件的10.3.4對于彈性體、涂層材料、復合材料、多層材料等，由于完整表面與切割表面存在潛在的浸提性能差異，因此應盡量完整地進行浸提。對于一些材料如彈性體和膠乳，經論證，1.25cm2/mL的浸提比例可能是適宜的。10.3.5浸提時應使用極性和非極性兩種介質。某些器械在特定的情況下，僅在一種浸提介質(極性或非極性)中進行浸提可能是適宜的。如果只在一種介質中浸提，則應提供理由。以下是浸提介質的示例。細胞毒性試驗中首選使用含血清培養基作為浸提介質，因為它具有支持細胞生長以及浸提極性和非極性物質的能力。10.3.6浸提宜在持續機械攪動或循環的條件下進行。當認為靜態條件或間歇攪動下進行浸提是適宜的，則應對試驗方法加以論證、規定并出具報告。宜注意不要損壞樣品或容器。10.3.7如可能，液體浸提液宜在制備后立即使用，以防止吸附在浸提容器上或成分發生其他變化。如果浸提液貯存時間超過24h(例如在2℃~8℃條件下冷藏),則應驗證貯存條件下浸提液的穩定性和均一性。10.3.8不應調整浸提液的pH,除非給出理由。10.3.9浸提液通常不應采用過濾、離心或其他方法來去除懸浮的粒子。但是，如有必要進行此類處8a)在最終的試驗液制備中宜考慮試驗系統相容性、給入途徑以及溶解或降解的程度等因素。如d)經濟合作與發展組織(OECD)化學品試驗指南或類似的化學品試驗標準，能用作確定具體試9(資料性)A.1表A.1列出的材料可滿足所選試驗的試驗對照要求，研究者對選擇的適宜性負責。表A.1可用RM和對照品的示例陰性對照陽性對照天然乳膠不銹鋼天然乳膠 聚氨酯注：RM和對照品信息只是針對ISO10993(所有部分)中那些并不要求特定的RM或對·本表的縮略語是指可從A.2和A.3指定的來源獲得A.2已用于陰性對照或RM的材料有：高密度聚乙烯(PE)、低密度聚乙烯(PE)、無二氧化硅的聚二甲A.3已應用的陽性對照材料有：例如，含有有機錫添加劑的聚氯乙烯(PVC-org.Sn)、含有二乙基二硫代氨基甲酸鋅(SPU-ZDEC)的聚氨酯棒或薄膜或二乙基二硫代氨基甲酸鹽(SPU-ZDBC)、具有已知刺激性物質的PVC、某些乳膠配方、鋅鹽溶液和銅，以及已用于浸提液樣品陽性對照的苯酚和水的稀(資料性)試驗樣品制備和樣品選擇的基本原則與規范用于生物學測定的材料宜代表最終產品的成分和表面特征以及加工過程(見第7章)。塑料和橡膠材料成分的描述文件宜包括樹脂、聚合物和添加劑的識別。配方說明宜詳細說明材料可用同一方法或替代方法再次滅菌的材料宜經多次滅菌處理后進行試驗。例如，一種材料經輻照滅菌并經環氧乙烷再次滅菌，則宜對經過輻照和環氧乙烷滅菌后的最終產品上進行試驗。理想的情況下，所有使用從醫療器械上切取的材料或這個醫療器械組件本身作為試驗材料，或使用它們制備的浸提液作為試驗材料的生物學試驗，試驗時宜使材料表面與試驗系統的生物環境接觸。切模劑和退火、固化、清洗、滅菌等過程加工成微型醫療器械。這有助于評價表面積、表濃度、材料表面和形狀相關的作用。生物學試驗中使用的金屬宜取自與制造器械相同的原材料，并用與最終產品制造相同的車、磨、拋、生物學試驗中使用的陶瓷材料宜用與器械生產同批粉料并用與器械制造相同的鑄造、熔模鑄造、澆使用動物組織或其衍生物并用固定劑進行處理的醫療器械，宜在制造商規定的最大和最小允許固定時間下保存后進行測試，以考慮固定劑的不同滲透度。作為金屬材料浸提液應用于試驗系統的替代方式，宜考慮檢驗器械中鑒別出的特定金屬鹽的各種濃度的溶液，以識別特定金屬離子的危險并確定其最高無反應水平。對于臨床使用中能導致產生體內微粒的植入材料，在設計材料試驗時宜考慮材料的浸提條件。試驗設計時宜考慮浸提程序的作用，浸提條件是否會產生微粒。材料總量和表面積宜與試驗系統的生物學和物理學要求相適應。在實際操作時，推薦將標準樣品量用于特定試驗。本文件請使用者注意ISOGuide33引言中關于CRM“正確使用”與“錯誤使用”的論述，該討論指出了存在的RM和標準樣品的范圍內使用和超范圍使用的情況。本文件的使用者也宜注意，在單一實驗室研究中使用校準材料評價材料的生物學反應是可接受的。(資料性)試驗樣品浸提原則警示——對含蛋白的醫療器械材料使用本文件的試驗方法時，應特別注意以確保浸提程序不會改變所浸提材料的生物學特性。C.1進行醫療器械的浸提以提供適合生物學評價試驗的試驗樣品。當制備器械浸提液時，所用的浸提介質和浸提條件宜既要與最終產品的性質和用途相適應，又要與試驗方法的可預見性(如試驗目的、原理、敏感性等)相適應。因此理想的浸提條件和試驗系統浸提液的應用宜是不僅要反映產品的實際使用條件，還要反映試驗的目的和可預測性。在正常使用條件下液體通過器械進行循環時，如體外循環器械，若有專用標準，宜執行其中所規定的相應的浸提技術。生物學試驗用于識別危險并評估其在加嚴使用中和/或實際使用中的風險。C.2本文件假定可浸提物的量與浸提時間、溫度、材料表面積與浸提液體積比，以及浸提介質的屬性有關。C.3浸提時間宜充分，以使材料的浸提量達到最大。實施中推薦用這些標準的浸提時間和溫度條件替代其他未經確認的和非標準條件。C.4不同的供試材料能采用不同的浸提溫度。浸提不宜使材料發生明顯降解，除非該材料在預期使用中是溶解或吸收的(見10.3.2)。浸提溫度依據器械材料的物理-化學特性而定。如，聚合物浸提溫度宜選擇在T。以下。如果T。低于使用溫度，浸提溫度宜低于熔化溫度。10.3.1中給出了推薦條件。以下示例用于說明和解釋10.3.1。——熔點和軟化點低于(121±2)℃的材料能在低于該熔點的某一標準溫度下浸提(如密度很低的——預期水解的材料能在使水解量最小的溫度下浸提[如聚酰胺采用(50±2)℃浸提]。——經過蒸汽滅菌且在貯存期內含有液體的材料和器械，能采用(121±2)℃浸提(如預充液的透析宜在能使浸提物達到最大量而不使材料降解的溫度下浸提材料[例如，經固定的組織能采用(37±1)℃浸提，而陶瓷植入物能采用(121±2)℃浸提]。如果已知可吸收的降解產物會影響試驗系統的pH,則可適當調整浸提液的pH,以評估pH的維持是否會影響試驗結果。隨附的生物相容性風險評估宜包括調整pH的理由、最初浸提液的pH、最終浸提液的pH和pH調整過程，以及對與pH相關的假設的臨床意義的討論。對于聚合物可吸收材料，在體溫以上的并接近或高于T。的浸提可導致聚合物特性發生變化(例如降解),這種變化不能代表臨床狀況，宜避免使用。對于可吸收金屬，升高的浸提溫度可能會引入新的且可能沒有代表性的腐蝕機理。因此，對于大多數可吸收的聚合物和金屬，10.3,1中列出的標準浸提溫度可能不適用。在評價可吸收器械時，有可能考慮浸提部分降解的材料及其相關的中間降解產物。C.5器械表面積與浸提液或溶劑的體積比宜滿足下列要求：——在適宜的劑量范圍內獲得最大量的可浸提物，以進行生物學試驗(即生理限度內的劑量范圍);C.5和C.6中所給參數的標準化，使醫療器械的生物學試驗所得到的數據能應用于其他方面。——按表1給出的條件；C.8對在原位聚合的產品，尚不能就其特殊需求給出標準的浸提液制備方法。當設計溶劑浸提方法(資料性)聚合材料生物學評價的極限浸提D.1總則聚合材料中通常含有少量的低分子質量化學物質(LMWCs),如催化劑、加工助劑或其他添加劑、殘留單體、低聚物等。聚合材料生物學評價中主要關注的毒性反應是在器械使用中從聚合物釋放至人體的可瀝濾物的毒性。該理念源自OECD聚合物工作組針對人體健康考量和豁免聚合物試驗的協議。該報告指出了以下4個對于判定聚合物健康風險非常重要的參數：——聚合物的數均分子質量；——低分子質量化學物質的含量；——反應性官能團的存在(見參考文獻[19]);——生物可利用金屬的存在。進行聚合物器械的生物學評價時，需要制備試驗樣品的浸提規范(植入試驗、直接接觸的血液相容性和直接接觸細胞毒性試驗除外)。附錄C中指出了加嚴浸提適用于危險識別。在聚合物器械，特別是長期使用聚合物器械的危險識別中，使用有機溶劑進行極限浸提是另一可供使用的規范。本規范原理是基于下列考慮：——對于危險識別，推薦盡可能從聚合物器械中獲得可浸提物的總量并在每一試驗系統中合理應用； 些文獻報道表明，當從聚合材料中浸提化學物(鄰苯二甲酸鹽、4.4’-二氨基二苯甲烷、雙酚A)時，體液(如血清)與有機溶劑(如乙醇和甲醇)的浸提結果相比具有可比性；——在聚合物分析領域內，常規使用有機溶劑對聚合物中LMWCs進行識別或定量。D.2用極限浸提進行聚合物醫療器械的生物試驗的考慮要點聚合物及其中的添加劑的種類很多。因此，沒有一種溶劑普遍適用于所有聚合物的極限浸提。例如，在ISO/TC194組織的國際聯合比對(round-robin)研究中，選擇丙酮-三氯甲烷混合物對橡膠樣品進行極限浸提，該研究比較了制備橡膠樣品致敏試驗的試驗浸提液中傳統浸提方法和極限浸提程序的能效。但是，這種溶劑混合物通常不適用于所有聚合物材料的極限浸提，因此，建議根據具體情況選擇合適的溶劑來極限浸提聚合物醫療器械。以下是為生物學試驗中極限浸提聚合物醫療器械時考慮的要點。——為了評價醫療器械的生物相容性，出于危險識別的目的，宜考慮在極性和非極性溶劑中浸提醫療器械。所選的溶劑不宜損害(例如，嚴重腫脹、微粒的產生和降解)醫療器械。另外，宜為所選的浸提溫度提供依據。——對于極限浸提，浸提時間不能預先給出規定，但能按以下方式處理。用所選溶劑按固定時間(如24h)對樣品進行系列浸提，并定期換新鮮的溶劑進行重復浸提至另一固定時間。當第n次浸提的殘留物水平為首次浸提水平的1/10時，有可能認為是完全浸提。重量分析或其他分析方法可能用于確定是否達到極限浸提終點。 —浸提殘留物是通過在極限浸提后蒸發溶劑或其他干燥過程獲得的。宜提供數據以證明蒸發或干燥過程以及隨后的復溶步驟(如下所述)不會引起浸提物中揮發物和/或半揮發性化合物的對于這種情況，與存在于加嚴的生物浸提條件中(見10.3和附錄C)的可浸提物/可瀝濾物相[1]GB/T16886.1—2022醫療器械生物學評價第1部分：風險管理中評價與試驗[2]ISOGuide30:201[3]ISOGuide31Referencematerials[4]ISOGuide33Referencematerials[5]ISOGuide35Referencematerials—[8]ISO17034Generalrequirementconceptsandassociatedterms[11]國際理論和應用化學會(IUPAC)分析術語綱要(IUPACCompendiumofAnalyticalNo-[12]UnitedStatesPharmacopeia/[13]TheJapanSocietyforAAnalysisHandbook,pp.549-558,Kinokuniya-Shoten,Tokyo,1995(ISBN2012.BasicPrinciplesofBiologicalSafetyEv[15]MHLWNotification(Tsuuchivices.IyakushinNo.0213001,2003.02.Principles,issuedbytheMHLWNotificationNo.0213001,2003.02.13,Iryokiki-ShinsaNo.36,MeetingofOECDExpertsonPolymers(Tokyo,14-16April1993),ChairmofSiliconeGelBreastImplantAging,Plast.Reconstr.Surg.,101,[21]AshM.andI.HandbookofPlasticandRubberAdditivthan13000ProductsbyTradeName,Chemical,Function,andManufacturer,Goveuseinbiocompati