11.牙膏中微生物檢驗方法總則12.牙膏中菌落總數檢驗方法13.牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法14.牙膏中銅綠假單胞菌檢驗方法15.牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗方法16.牙膏中霉菌和酵母菌總數檢驗方法\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件1.doc"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件1.doc\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件2.doc"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件2.doc\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件3.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件3.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件4.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件4.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件5.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件5.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件6.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件6.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件7.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件7.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件8.doc"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件8.doc\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件9.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件9.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件10.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件10.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件11.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件11.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件12.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件12.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件13.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件13.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件14.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件14.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件15.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件15.docx\o"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件16.docx"國家藥品監督管理局2024年第13號通告附件16.docx附件11牙膏中微生物檢驗方法總則GeneralGuidelinesinToothpaste1范圍本部分規定了牙膏微生物學檢驗的基本要求。 本部分適用于牙膏樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2儀器和設備2.1天平：0~200g，精確至0.1g。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶：250mL、150mL。2.5玻璃珠。2.6無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。2.7均質器。2.8滅菌均質袋。3培養基和試劑3.1SCDLP液體培養基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加熱溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調pH為7.2~7.3分裝，每瓶90mL，121℃高壓滅菌20min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25℃左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。4樣品的采集及注意事項4.1所采集的樣品，應具有代表性，一般視每批牙膏規格大小，隨機抽取相應數量的包裝單位。檢驗時，應從不少于2個包裝單位的樣品中共取10g。包裝量小于20g的樣品，采樣時可適當增加樣品包裝數量。4.2供檢樣品，應嚴格保持原有的包裝狀態。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。4.3接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應置于陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。4.4若只有一個樣品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、化學等，則宜先取出部分樣品做微生物檢驗，再將剩余樣品做其他分析。4.5在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在符合生物安全要求的實驗室中進行。5供檢樣品的制備稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mLSCDLP液體培養基（或經過驗證等效或優于SCDLP的稀釋液）三角瓶中，充分振蕩混勻，作為1:10的檢液。使用均質器時，則采用滅菌均質袋，稱10g樣品加入90mLSCDLP液體培養基（或經過驗證等效或優于SCDLP的稀釋液），均質1min~2min，充分混勻后，作為1:10的檢液。附件12牙膏中菌落總數檢驗方法AerobicPlateCountinToothpaste1范圍本規范規定了牙膏中菌落總數的檢驗方法。本規范適用于牙膏中菌落總數的測定。2定義2.1菌落總數Aerobicplatecount牙膏檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度、培養時間、pH值、需氧性質等）培養后，1g檢樣中形成的微生物菌落總數。所得結果包括本方法規定的條件下生長的嗜中溫需氧菌和兼性厭氧菌的菌落總數。測定菌落總數便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛生學總評價的綜合依據。3儀器和設備3.1三角瓶：250mL。3.2量筒：200mL。3.3pH計或精密pH試紙。3.4高壓滅菌器。3.5試管：18mm×150mm。3.6滅菌平皿：直徑90mm。3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.8酒精燈。3.9恒溫培養箱：36℃±1℃。3.10放大鏡。3.11恒溫水浴箱。4培養基和試劑4.1SCDLP液體培養基見總則3.1。4.2卵磷脂、吐溫80—營養瓊脂培養基成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調pH值為7.1~7.4，加入瓊脂，121℃高壓滅菌20min，儲存于冷暗處備用。4.30.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenylterazoliumchloride，TTC）成分：TTC0.5g蒸餾水100mL制法：溶解后過濾除菌，或115℃高壓滅菌20min，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。5操作步驟5.1用滅菌吸管吸取1:10的檢液2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1mL。另取1mL注入到9mLSCDLP液體培養基（或經過驗證等效或優于SCDLP的稀釋液）試管中（注意勿使吸管接觸液面），并充分混勻，制成1:100檢液，更換一支吸管，吸取2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1mL。樣品至少需進行1:10和1:100稀釋，如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每個稀釋度應換1支吸管。5.2將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基傾注到平皿內，每皿約15mL，隨即轉動平皿，使檢液與培養基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃培養箱內培養48h±2h。同時吸取1mL空白稀釋液加入滅菌空平皿中，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃培養箱內培養48h±2h，為空白對照。5.3為便于區別牙膏中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養后菌落呈紅色，而牙膏的顆粒顏色無變化。6菌落計數方法先用肉眼觀察，點數菌落數，然后再用5倍~10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數后乘以2，以代表全皿菌落數。7菌落計數及報告方法7.1首先選取平均菌落數在30~300之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數報告之（見表1中例1）。7.2若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30~300之間，則應求出兩菌落總數之比值來決定，若其比值小于或等于2，應報告其平均數，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數報告之（見表1中例2及例3）。7.3若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例4）。7.4若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1例5）。7.5若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，其中一個稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例6）。7.6若所有的稀釋度均無菌生長，報告數為每g小于10CFU。7.7菌落計數的報告，菌落數在10以內時，按實有數值報告之，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數，可用10的指數來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數為“不可計”時，應注明樣品的稀釋度。表1細菌計數結果及報告方式例次不同稀釋度平均菌落數10-110-210-3兩稀釋度菌數之比菌落總數（CFU/g）報告方式（CFU/g）1136516420─1640016000或1.6×10422760295461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可計4650513─513000510000或5.1×105527115─270270或2.7×1026不可計30512─3050031000或3.1×1047000─＜1×10＜10注：CFU-菌落形成單位。7.8以CFU/g為單位報告。附件13牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法DetectionofThermotolerantColiformBacteriainToothpaste1范圍本規范規定了牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗方法。本規范適用于牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗。2定義2.1耐熱大腸菌群Thermotolerantcoliformbacteria系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃培養24h～48h能發酵乳糖產酸并產氣。該菌主要來自人和溫血動物糞便，可作為糞便污染指標來評價牙膏的衛生質量,推斷牙膏中有否污染腸道致病菌的可能。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44.5℃±0.5℃。3.2溫度計。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環。3.6電磁爐。3.7三角瓶：250mL。3.8試管：18mm×150mm。3.9小倒管。3.10pH計或pH試紙。3.11高壓滅菌器。3.12無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.13滅菌平皿：直徑90mm。4培養基和試劑4.1SCDLP液體培養基見總則3.1。4.2雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫8014g蒸餾水1000mL制法：將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調pH為7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管，每管10mL（每支試管中加一個小倒管）。115℃高壓滅菌20min。4.3伊紅美藍（EMB）瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀和蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。調pH值為7.2~7.4，分裝于三角瓶內，121℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中無菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL0.5%美藍水溶液，搖勻，冷至45℃~50℃，傾注平皿備用。4.4蛋白胨水（靛基質試驗用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱融化，調pH值為7.0~7.2，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。4.5靛基質試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗方法：接種細菌于蛋白胨水中，于44.5℃±0.5℃培養24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL~0.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。4.6革蘭氏染色液：4.6.1染液制備結晶紫染色液：結晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。脫色液：95%乙醇。復染液：（1）沙黃復染液：沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。（2）稀石碳酸復紅液：稱取堿性復紅10g，研細，加95%乙醇100mL，放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復紅液。4.6.2染色法將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脫色，約30s，或將乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s，水洗。滴加復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。4.6.3染色結果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染，復染時間僅需10s。5操作步驟5.1取10mL1:10的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養基中，置44.5℃±0.5℃培養箱中培養24h±2h，如既不產酸也不產氣，繼續培養至48h±2h，如仍既不產酸也不產氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。5.2如產酸產氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h~24h。同時取該培養液1~2滴接種到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培養24h±2h。經培養后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應注意挑選。5.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養液中，加入靛基質試劑約0.5mL，觀察靛基質反應。陽性反應液面呈玫瑰紅色；陰性反應液面呈試劑本色。5.5如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統，可從營養瓊脂平板上挑取經純化的可疑菌落，用無菌稀釋液制備成濁度適當的菌懸液，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統進行鑒定。6檢驗結果報告經上述檢驗步驟，若發酵乳糖產酸產氣，平板上有典型菌落，并經證實為革蘭氏陰性無芽胞短桿菌，靛基質試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。附件14牙膏中銅綠假單胞菌檢驗方法DetectionofPseudomonasAeruginosainToothpaste1范圍本規范規定了牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗方法。本規范適用于牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗。2定義銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，大部分能產生綠膿菌素。3儀器3.1恒溫培養箱：36℃±1℃、42℃±1℃。3.2三角瓶：250mL。3.3試管：18mm×150mm。3.4滅菌平皿：直徑90mm。3.5無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針、接種環。3.9電磁爐。3.10高壓滅菌器。3.11恒溫水浴箱。4培養基和試劑4.1SCDLP液體培養基見總則3.1。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4~7.6，加入瓊脂，115℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.3乙酰胺培養基成分：乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）0.5g酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測定用培養基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學純）10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，115℃高壓滅菌20min后，制成斜面備用。4.5明膠培養基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加熱使之溶解，調pH至7.4，分裝于試管內，經115℃高壓滅菌20min后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調pH為7.2，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min后備用。4.7普通瓊脂斜面培養基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調pH為7.2~7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌20min后，制成斜面備用。5操作步驟5.1增菌培養：取1:10檢液10mL加到90mLSCDLP液體培養基中，置36℃±1℃培養18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。5.2分離培養：將增菌后的培養物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離，將增菌后的培養物劃線接種于平板上，置36℃±1℃培養24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基呈紅色，其他菌不生長。5.3純化：挑取可疑菌落劃線接種于營養瓊脂平板上純化，于36℃±1℃培養18h~24h。5.4染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色（見牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法4.6.2），鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。5.5氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在15s~30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養物不變色，為氧化酶試驗陰性。5.6綠膿菌素試驗：取可疑菌落2個~3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.7硝酸鹽還原產氣試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在硝酸鹽胨水培養基中，置36℃±1℃培養24h±2h，觀察結果。凡在硝酸鹽胨水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。5.8明膠液化試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置36℃±1℃培養24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液狀或表面液化時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。5.942℃生長試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，置于42℃±1℃培養箱中，培養24h~48h，銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。5.10如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統，可從營養瓊脂平板上挑取經純化的可疑菌落，用無菌稀釋液制備成濁度適當的菌懸液，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統進行鑒定。6檢驗結果報告被檢樣品經增菌分離培養后，平板上有可疑菌落，并經證實為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗陰性而明膠液化、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。附件15牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗方法DetectionofStaphylococcusAureusinToothpaste1范圍本規范規定了牙膏中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。本規范適用于牙膏中金黃色葡萄球菌的檢驗。2定義金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。3儀器和設備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養箱：36℃±1℃。3.3離心機。3.4無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.5試管：18mm×150mm。3.6載玻片。3.7酒精燈。3.8三角瓶：250mL。3.9高壓滅菌器。3.10恒溫水浴箱。4培養基和試劑4.1SCDLP液體培養基見總則中3.1。4.2營養肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.37.5%氯化鈉肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.4BairdParker平板成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCl·6H2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH7.0±0.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃，調節pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預熱至50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h±2h。4.5血瓊脂平板成分：營養瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營養瓊脂加熱融化，待冷至50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內備用。4.6甘露醇發酵培養基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（115℃10lb）20min滅菌備用。4.7滅菌液體石蠟制法：取液體石蠟50mL，121℃高壓滅菌20min。4.8兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，121℃高壓滅菌30min，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm~3000rpm離心3min~5min。血球下沉，取上面血漿。5操作步驟5.1增菌：取1:10的檢液10mL接種到90mLSCDLP液體培養基中，置36℃±1℃培養箱，培養24h±2h。5.2分離：自上述增菌培養液中，取1~2接種環，劃線接種到BairdParker平板上，如無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板上，置36℃±1℃培養48h±2h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板培養基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置36℃±1℃培養24h±2h。5.3染色鏡檢：挑取血瓊脂平板上分純后的菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5mm~1mm。5.4甘露醇發酵試驗：取血瓊脂平板上分純后的菌落接種到甘露醇發酵培養基中，在培養基液面上加入高度為2mm~3mm的滅菌液體石蠟，置36℃±1℃培養24h±2h，金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。5.5血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿0.5mL