第一節(jié)組織培養(yǎng)所需要的根本條件所需條件實驗室設置儀器設備無菌條件一、實驗室的設計與要求

實驗室的設計和裝備程度應依據(jù)工作目的、規(guī)模以及實際的經(jīng)濟狀況而定。 〔一〕化學實驗室 〔二〕無菌操作室 〔三〕培養(yǎng)室 〔四〕觀察鑒定室 〔五〕馴化移植室〔一〕化學實驗室用途:化學實驗室是進行預處理和前期準備的場所器皿、用具的洗滌、枯燥、滅菌和保存培養(yǎng)基配制植物材料的清洗和預處理存放各種器皿、設備和藥品等需要的裝備:化學實驗室應有實驗臺、藥品柜、防塵櫥或防塵柜冰箱、烘箱、天平、酸度計、水浴鍋、電爐、滅菌鍋、蒸餾水器等設備也可存放于該室的不同位置，相應的操作也在該室中進行。要求干凈明亮，氣流暢通。〔二〕無菌操作室用途：無菌操作室也稱無菌室或接種室，它是組織培養(yǎng)中進行無菌操作的場所。設備：超凈工作臺

、滅菌器等。要求：一般要求室內干爽、整潔、明亮，墻壁光滑平整不易積染灰塵，地面平坦無縫便于清洗和消毒。室內應盡量少放設備和器械，除在出入口安裝移動滑門外，其他門窗均應密閉，以保證沒有通風和空氣對流，通風換氣必須通過空氣調節(jié)裝置進行。定期用甲醛和高錳酸鉀或其他藥劑進行消毒滅菌，室內的上方和門口也應安裝紫外燈，使室內保持良好的無菌或少菌狀態(tài)。

無菌室外應設緩沖室

接種室超凈工作臺紫外燈緩沖室消毒藥消毒器滑門〔三〕培養(yǎng)室用途：培養(yǎng)室是培養(yǎng)接種材料的場所。設備：搖床、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、空調、加濕除濕設備、時間程控器械。要求：優(yōu)越的照明條件：日光燈良好的溫控條件：自動控溫電爐或空調等能夠保持一定的濕度：除濕機、加濕機〔器〕能進行通風換氣。通風窗口或加裝排風扇環(huán)境條件的控制與要求〔四〕觀察鑒定室離心機〔五〕馴化移植室用途：主要用于試管苗的馴化和移栽；也可用于母株的預栽培。設施：室內應備有彌霧裝置、蔭棚、移植床〔苗床〕、恒溫恒濕控制儀、光照調節(jié)裝置等設施以及培養(yǎng)土、培養(yǎng)盆〔缽〕、育苗盤等器材。馴化移植室1、2二、常用儀器設備與器械〔一〕常用儀器設備：超凈工作臺；高壓蒸汽滅菌鍋；冰箱；烘箱；天平；蒸餾水器；酸度計；搖床與轉床；光照培養(yǎng)箱〔二〕常用器皿與器械1．培養(yǎng)器皿(圖2)2．盛裝器皿3．計量器皿4．滅菌器械5．接種器械6．其他：漏斗、玻璃棒、落水架、器械支架、洗瓶、毛刷等。三、環(huán)境條件的控制與要求〔一〕光照1．光周期:一般采用周期性照顧的方法。但對不同植物、不同培養(yǎng)物的特性、不同培養(yǎng)階段所采取的措施不同。通常在愈傷組織誘導階段，一般采用三種方法：全暗、周期性光照、散射性光照。多數(shù)植物適宜全暗或弱光下培養(yǎng)；而在器官分化階段，那么需要一定時間的光照。一般每天10~16h的光照即可滿足大多數(shù)培養(yǎng)的需要；2.光照強度：一般光強在1000~3000lx；一般在培養(yǎng)的后期如生根階段增強光照強度。3.光質：離體培養(yǎng)條件下，一般采用日光燈進行光照，光譜成分主要是藍紫光，光譜的波長為419~467nm。一、控制污染的重要性二、污染類型真菌污染與細菌污染〔區(qū)別表〕三、造成培養(yǎng)物污染的途徑及防除措施 ①培養(yǎng)器皿； ⑤培養(yǎng)室環(huán)境； ②培養(yǎng)根本身； ⑥操作器械； ③植物材料； ⑦操作人員。 ④接種室環(huán)境；污染類型特征來源途徑發(fā)生時間細菌污染黏液狀或發(fā)酵泡狀菌斑；出現(xiàn)渾濁或云霧狀痕跡材料帶菌操作人員不慎培養(yǎng)基滅菌不徹底接種后1-2天真菌污染形成不同顏色和形狀的霉層材料帶菌接種環(huán)境超凈工作臺失效接種后5-10天表4細菌污染與真菌污染的主要區(qū)別真菌污染2〔一〕培養(yǎng)器皿的清洗和滅菌2．培養(yǎng)器皿的滅菌〔1〕高壓蒸汽滅菌法。〔2〕干熱滅菌法。烘箱中150℃〔40分鐘〕或120℃〔2小時〕。1．培養(yǎng)器皿的清洗

:簡單清洗去除污物

泡于洗滌液

自來水刷洗清水反復沖洗蒸餾水漂洗烘干或涼干使用或暫存〔二〕培養(yǎng)基的滅菌1.高壓蒸汽滅菌法A.裝鍋不可過滿，要使鍋內留有一定空間，便于熱蒸汽的暢通。B.正式滅菌前將鍋內冷空氣排盡。C.要根據(jù)滅菌對象的性質嚴格把握滅菌時間和滅菌溫度。

2.過濾滅菌法A.適用于液體培養(yǎng)基B.培養(yǎng)基中易在高溫高壓下分解減效或失效的物質。(濾膜孔徑為0.22~0.45μm)。培養(yǎng)基分裝量與高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間*20~501575~15020250~50025100030150035培養(yǎng)基分裝量（mL）在121℃下滅菌所必需的最少時間(min)200040120℃

121℃

122℃

排汽一定舒緩，以免造成培養(yǎng)基沸騰，沾染瓶塞引起污染。負壓過濾器〔三〕植物材料消毒1．減少材料帶菌的防范措施〔1〕取材前對母株的預處理：減少帶菌時機，改善生理狀態(tài)。〔2〕對采來的離體材料進行清洗、刮除、沖洗等預處理。〔3〕確定最正確的取材時期。〔4〕內部已污染的材料棄之不用。2.材料外表滅菌〔1〕對滅菌劑的要求〔2〕常用滅菌劑種類〔3〕滅菌方法常用外表滅菌劑的使用及其效果種類使用濃度（%）滅菌時間（分）滅菌效果酒精升汞漂白粉次氯酸鈉次氯酸鈣70-750.1-0.2飽和上清液2-109-100.1-55-128-155-305-30（+）好（+++）極好（++）很好（++）很好（++）很好滅菌效果好：徹底、平安、高效。對植物材料傷害小；滅菌劑易消除或易分解對滅菌劑的要求外表滅菌方法滅菌劑的使用依據(jù)材料特性〔植物種類、取材部位、大小、老嫩等〕確定滅菌劑的種類、處理時間和處理濃度。做到既到達良好的滅菌效果又不損傷材料。一般多種藥劑配合使用，交替浸泡、綜合殺菌。對于外表具有蠟質層、絨毛的材料，滅菌時可參加少量浸潤劑〔如吐溫-20〕或輔以磁力攪拌、超聲振動等措施，以提高滅菌效果。滅菌劑要充分浸沒材料。滅菌處理后，材料必須在無菌水中漂洗3-5次，以除去外表殘留的滅菌劑。經(jīng)常清掃，保持清潔；接種室消毒：室內空氣消毒：熏蒸滅菌法紫外燈照射滅菌 噴霧降塵室內地面、墻壁、桌面等：用消毒液〔2%的新潔爾 或70%的酒精〕擦拭滅菌。接種臺消毒: 紫外燈照射 70%-75%的酒精噴霧或擦拭臺面。使用超凈工作臺:〔四〕接種室環(huán)境滅菌超凈工作臺粗過濾器高效過濾器操作臺面使用超凈工作臺應注意的問題

超凈工作臺不應安裝在塵埃太多的地方。

在使用前應預熱30-40分鐘。

操作前應先將實驗材料和操作器械、藥品等物品事先放入臺內，不要中途拿進。

臺面上放置的東西不宜太多，特別是注意不要把東西迎面堆的太高，以免擋住氣流。

定期檢查，更換過濾器。〔六〕接種器械的滅菌〔五〕培養(yǎng)室環(huán)境滅菌〔1〕定期清掃，保持整潔；〔2〕地面、墻壁、培養(yǎng)架以及其他器材外表：用消毒劑進行擦洗或噴霧：酒精、來蘇兒水、新潔爾滅。〔3〕空氣滅菌：紫外燈照射； 定期熏蒸滅菌〔改用乙二醇〕 噴霧滅菌。〔3〕濕度不宜過大〔60%-80%〕。〔1〕進入接種室前應洗凈雙手，穿好工作服，戴好工作帽和口罩。〔2〕接種操作前用75%的酒精擦拭雙手。〔3〕接種操作時要端座，不要俯身工作臺，口鼻遠離接種區(qū)〔如瓶口〕，盡量不要講話。〔4〕翻開培養(yǎng)瓶口〔拔棉塞時和蓋棉塞時〕前和蓋蓋之前，堅持灼燒培養(yǎng)瓶口和蓋口〔或棉塞〕，將微生物固定，防止進入瓶內。〔5〕接種過程中手臂切忌從培養(yǎng)基、無菌材料、接種器械等物品上方經(jīng)過，以免引起污染。〔6〕當培養(yǎng)容器敞著口時，應傾斜瓶口防止污染物進入培養(yǎng)容器。〔七〕操作人員的無菌操作第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制根本培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基的作用一、培養(yǎng)基的組成及其作用〔一〕無機元素〔二〕有機營養(yǎng)〔三〕植物生長調節(jié)物質〔四〕附加物類〔五〕培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓二、培養(yǎng)基種類及其特點三、培養(yǎng)基的配制根本培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基維生素、氨基酸糖、淀粉椰乳、蘋果汁、香蕉泥植物激素C、H、O、NS、P、B、I抗生素K+、Ca2+、

Mn2+

Mg2+、

Zn2+炭粉根本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基根據(jù)植物所需濃度分為大量元素〔>0.5mmol/L〕和微量元素〔1〕大量元素種類：C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg等。作用：N元素：組培中利用的無機氮主要有硝態(tài)氮(NO3-)和銨態(tài)氮(NH4+)兩種形式.應注意：A.培養(yǎng)基中一般硝酸鹽和銨鹽按一定比例配合使用，兩者比例大小應根據(jù)植物種類做適宜調整。B.培養(yǎng)基中硝酸鹽和銨鹽各自的含量過高或過低或比例不當，均不利于培養(yǎng)物的培養(yǎng)(一般硝酸鹽≥25mmol/L,銨鹽＜8mmol/L)。〔一〕無機元素種類：主要包括Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Na、Co、B、I等。作用：微量元素在植物生命活動過程中，多以酶系中的輔基形式起著重要作用。使用中應注意的問題假設使用量過大，常會引起植物細胞酶系失活、代謝障礙、蛋白質變性以及組織死亡等毒害現(xiàn)象。來源問題不同培養(yǎng)基配方中的用量差異很大植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基中離子濃度的比較〔2〕微量元素植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基中離子濃度的比較NO3mmol/L3.3339.4133.7925.0018.4027.99NH4

20.6215.002.009.007.01總N

3.3360.0348.7927.0327.4035.00P

0.141.252.501.080.502.94K

1.6620.0521.2925.009.9030.93Ca

1.272.992.991.021.491.13Mg

3.041.501.501.000.750.75Cl

0.875.985.982.042.992.26Feμmol/L12.50100.00100.0050.10100.00100.00S

4502.001730.001610.002079.90996.804379.13Na

2958.00202.00237.201089.00202.00202.00B

24.20100.0010.0048.50161.8025.88Mn

22.40100.0010.0059.20112.0019.73Zn

10.4030.0037.307.0034.705.22Cu

0.040.100.010.100.10

Mo

0.0071.000.101.001.00

Co

0.100.010.10

離子單位WhiteMSERB5NitschN6I

4.505.00

4.50

4.82〔二〕有機營養(yǎng)1.碳水化合物2.氨基酸3.維生素4.有機添加物幾種培養(yǎng)基有機成分的比較肌醇100

100

100煙酸0.50.50.0550.51吡哆醇0.50.50.010.50.51硫胺素0.40.50.010.5110甘氨酸22322

葉酸

0.5

生物素

0.05

培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基（單位：mg/L）*MSERWhiteNitschN6B5蔗糖3%4%2%2%5%2%1.碳水化合物2.氨基酸類3.維生素類種類作用使用量(1mg/L)鹽酸硫胺素（VB1）

促進細胞分裂,愈傷組織的形成0.4~1鹽酸吡哆醇（VB6）

促進根的形成與生長0.5~1煙酸（Vpp）促進植物代謝和胚胎發(fā)育

0.5~1肌醇（Myo-inositol）

促進細胞壁的形成和愈傷組織增殖；促進培養(yǎng)物生長、胚狀體和芽的形成；肌醇還有助于其他活性物質發(fā)揮作用50~100抗壞血酸（Vc）

防止組織褐變

50-2004．天然有機添加物類

種類：多種多樣，如椰乳、馬鈴薯汁、麥芽浸出物、酵母提取物等。應用有時必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可行，但不能應用于定量化研究。〔三〕植物生長調節(jié)物質植物生長調節(jié)物質對于調節(jié)細胞分化、形態(tài)發(fā)生致關重要，是組培中的關鍵物質。種類：

生長素類

細胞分裂素類

赤霉素類

乙烯

脫落酸1.生長素類〔1〕作用：主要用于促進細胞分裂和芽的分化。 主要用于： 誘導芽的分化； 解除頂端優(yōu)勢，促進側芽生長與莖芽的增殖； 延緩組織衰老，增強蛋白質的合成，顯著改變 其他激素作用。〔2〕使用種類： 玉米素〔ZT〕、6-芐基腺嘌呤〔6-BA〕 沖動素〔KT〕、2-異戊烯基腺嘌呤〔2iP〕〔3〕活性強弱 ZT=2-iP>6-BA>KT。2.細胞分裂素類〔4〕應用情況：使用濃度范圍為0.1~10mg/L，常用的濃度為0.1~2mg/L。 ZT：作用最強；價格昂貴。 6-BA：應用最廣泛。 2iP：在某些木本植物〔杜鵑〕的莖芽分化中效果不錯 KT：可局部代替6-BA的作用。〔5〕穩(wěn)定性：6-BA和2-iP性質穩(wěn)定；ZT、KT易變性。〔6〕溶解性：0.5或1mol/LNaoH或HCL3.其他激素〔四〕附加物類3．抗生素作用：防止和控制菌類污染，減少培養(yǎng)材料的損失。種類：常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素、慶大霉素等，用量一般在5~20mg/L。使用抗生素不能代替無菌操作。4．抗氧化劑作用:控制或緩解培養(yǎng)材料的褐變種類:半胱氨酸、抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。5．生長抑制劑作用:調節(jié)內源與外源植物激素的平衡，利于培養(yǎng)物的生長和分化種類:根皮苷、三碘苯甲酸、矮壯素、比久〔B9〕、間苯三酚等〔五〕培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓1.培養(yǎng)基的PH〔1〕調節(jié)PH的必要性〔2〕調節(jié)方法：酸度計或精密pH試紙，配好的培養(yǎng)基常偏酸，偏堿的情況很少見。〔3〕調節(jié)依據(jù)培養(yǎng)基的pH因培養(yǎng)材料不同而異，大多數(shù)植物適宜的pH在5.6~6.0之間。pH的大小影響到培養(yǎng)基的固化程度。Ph>6.0時，培養(yǎng)基將會變硬；<5.0時，培養(yǎng)基不能很好的凝固。依據(jù)培養(yǎng)基中某些物質的穩(wěn)定性。Fecl2 PH>6.2失效 檸檬酸鐵 PH>6.0失效2．培養(yǎng)基的滲透壓

二、培養(yǎng)基種類及其特點

〔一〕培養(yǎng)基種類種類特點舉例高無機鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽的含量較高，微量元素種類齊全，營養(yǎng)組成和比例也比較合理，

MS、LS、BL、RM、ER等

較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基

KNO3的使用量遠遠高于其他無機鹽

B5、N6、SH、GS等

中等無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高

Nitsch、NT、H、Miller等

低無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低并且種類減少

改良White、Heller、WS、Knop、HB等

NH4NO31650

720

KNO31900809502830CaCl2.2H2O440

166CaCl2

166

MgSO4.7H2O370750185185KH2PO4170

68400(NH4)2SO4

463Ca(NO3)2.4H2O

300

Na2SO4

200

NaH2PO4.2H2O

19

KCl

65

KI0.830.75

0.8H3BO36.21.5101.6MnSO4.4H2O22.35254.4ZnSO4.7H2O8.63101.5NaMoO4.2H2O0.25

25

MoO3

0.001

CuSO4.5H2O0.0250.010.025

CoCl26H2O0.025

Fe2(SO4)3

2.5

FeSO4.7H2O27.8

27.827.8Na2.EDTA.2H2O37.3

37.337.3組成MSWhiteNitschN6三、培養(yǎng)基的配制配制母液量取母液并混合稱量瓊脂、蔗糖，充分熔解瓊脂。定容調PH分裝密封與標記滅菌使用或暫存第四節(jié)組織培養(yǎng)的根本程序選擇品種、植株、取材部位截取、切割外植體外植體的滅菌與接種

組培苗的馴化與移栽

離體培養(yǎng)、根芽形成、植株再生一、培養(yǎng)材料的選擇和預處理〔2〕取材季節(jié)〔3〕外植體大小的選擇外植體的大小應根據(jù)植物材料和培養(yǎng)目的而定：枝段、莖段：包含腋芽，一般0.5-2cm莖尖脫毒：0.2mm以下葉片、鱗片等：0.5-2cm23.材料的處理〔1〕母株的預栽培：溫室栽培、水培、暗培養(yǎng)等。〔2〕打破休眠：低溫和赤霉素處理。〔3〕對材料的簡單清理：去枯、去斑、清洗等。試材的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡的影響一般沿植物主軸，越向上局部所形成的器官的生長時間越短其生理年齡也相應越老，越接近發(fā)育上的成熟，越易形成花器官。沿植物主軸越向下，所形成的器官的生長時間越長其生理年齡也相應越幼，越易形成芽器官。如煙草的表皮組培中，下部組織產(chǎn)生營養(yǎng)芽的比例高，而上部產(chǎn)生花器官的比例大。二、外植體的滅菌與接種

1.外植體的滅菌2.接種：經(jīng)過滅菌的植物材料，按照不同的培養(yǎng)要求，經(jīng)過剪切、分割處理后，移至培養(yǎng)基上〔中〕的全部操作過程，稱為“接種〞。注意：接種于固體培養(yǎng)基上的材料要求既要和培養(yǎng)基到達最大面積的接觸，又要防止完全嵌入培養(yǎng)基。接種過程中應防止任何外界和操作不當引起的污染。單瓶內接多個材料時，應使之均勻分散開。1.調整好培養(yǎng)室的溫度、照顧、濕度等培養(yǎng)條件。2.定期進行觀察，根據(jù)變化做適宜調整。3.剔除遭污染的材料。三、外植體的培養(yǎng)外植體愈傷組織生根或壯苗完整試管苗四、組培苗的馴化與移栽〔一〕組培苗的特點1．根發(fā)育不良，無吸收功能或極低。2．莖葉外表缺乏保護組織，氣孔難以關閉并且開口過大，極易散失水分。3．葉綠體發(fā)育不良，葉綠素含量低，葉片的光合作用很弱。〔二〕組培苗的馴化與移栽1.原那么2.過程馴化過程應遵循逐步過渡的原那么。一般來說，在開始數(shù)天內，馴化條件應與離體培養(yǎng)時的環(huán)境條件相近，而在馴化后期，應逐步過渡到與自然栽培條件相仿。以實現(xiàn)：異養(yǎng)無菌自養(yǎng)高濕低濕恒溫變溫有菌弱光強光過渡離體培養(yǎng)條件自然生長條件組培苗的馴化移栽過程1.獲得根系良好的壯苗〔生根或壯苗階段〕。2.開瓶進行濕度和光照鍛煉；讓小苗直接接觸外界環(huán)境，加強光照強度，降低濕度，使小苗由異養(yǎng)逐步過度到自養(yǎng)。一般鍛煉一周左右。3.將經(jīng)初步鍛煉的小苗轉移到苗床上。〔1〕移栽前應將小苗基部的培養(yǎng)基洗凈，以免招致微生物侵染。〔2〕移栽后一定加強管理，注意保濕和遮蔭。〔3〕培養(yǎng)初期可以適當澆灌營養(yǎng)液。4.將成活的小苗移栽到大田。第五節(jié)外植體的褐變與玻璃化苗一、外植體的褐變〔一〕褐變的原因〔二〕影響褐變的因素〔三〕控制褐變的措施二、玻璃化苗〔一〕玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因〔二〕克服玻璃化苗的防范措施〔一〕褐變的原因褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少以及多酚氧化酶的活性有直接關系。

當外植體經(jīng)受切割處理時，酚類化合物外溢并與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下酚類化合物迅速被氧化成褐色的醌類物質，醌類又會在酪氨酸酶等酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活，從而導致整個組織代謝紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。〔二〕