食用菌生產多采用三級菌種繁育體系，也有采用二級菌種繁育體系的。經過擴大培養，增加菌絲體的適應能力，使其粗壯;并檢驗菌種生活力、純度;擴大菌種數量，滿足生產需要。第三章二級菌種和三級菌種的制備第一節培養料的配制與滅菌第二節接種與培養第三節質量鑒定第四節液體菌種生產和使用第一節培養料的配制與滅菌一、培養料的配制二、培養料的滅菌一、培養基的配制㈠培養料配制的原則㈡培養料常用配方㈢培養料配制工藝流程㈠培養料配制的原則●要選擇適宜的營養物質●營養物質配制的比例要適當●選擇經濟使用來源廣泛的原料●適宜的酸堿度㈡培養料常用配方

常用的配方為78：20：1：1

78：指供應碳源的主料，包括木屑、玉米芯、秸稈、稻草等。

20：指米糠、麩皮。

1：指糖。

1：石灰、石膏等㈡培養料常用配方木屑培養基棉籽殼、蔗糖培養基玉米芯、花生殼培養基

木屑培養基

﹡闊葉樹木屑78%，米糠或麩皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。木屑培養基

﹡闊葉樹木屑93%，米糠或麩皮5%，蔗糖1%，尿素0.4%，碳酸鈣0.4%，磷酸二氫鉀0.2%。木屑培養基

﹡闊葉樹木屑75%，麩皮22%，蔗糖1.5%，石膏粉1.4%，維生素B10.1%。

適用于平菇、鳳尾菇、木耳、猴頭、靈芝、金針菇、榆黃蘑等菌種的培養。

棉籽殼、蔗糖培養基

﹡棉籽殼78%，麩皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。棉籽殼、蔗糖培養基

﹡棉籽殼96%，蔗糖2%，過磷酸鈣1%，石膏粉1%。

適用于平菇、鳳尾菇、毛木耳、金針菇等菌種的培養。玉米芯、花生殼培養基

﹡玉米芯%，米糠或麩皮20%，蔗糖1%，石膏粉1%。玉米芯、花生殼培養基

﹡玉米芯80%，米糠10%，玉米粉8%，石膏粉1%，磷酸二氫鉀0.2%。

玉米芯、花生殼培養基

﹡花生殼78%，米糠20%，蔗糖1.5%，石膏粉1%。

適用于平菇、香菇、木耳、猴頭、靈芝等菌種的培養。㈢培養料配制工藝流程●稱料●拌料●調節pH●分裝培養料●分裝容器的封口●稱料

將預處理過的培養料（以不刺破容器為準，過4目的篩子），按生產規模進行稱取。先稱主料，后稱輔料。●拌料

將不溶性的料干混均勻，可溶性的料加少量的水配成母液，邊潑澆邊混拌，含水量為60%。●調節pH

將培養料堆悶0.5～1.0h后，測定酸堿度，因為滅菌后pH下降1～1.5，所以高調1～1.5，調致6.5～7.0較為合適。●分裝培養料

分裝培養料時，邊裝邊壓，松緊適中（中下部稍松，上部稍緊），然后平整料面，在料中央打洞。﹡料中央打洞的目的

1.增加培養料與空氣的接觸面積以利菌絲生長；

2.便于固定接種塊；

3.讓部分菌種掉進洞內，增加接種點，縮短發菌周期。●分裝容器的封口

﹡瓶裝容器的封口：罐頭瓶用12㎝×12㎝×0.004㎝的低壓聚乙烯或聚炳烯膜封口；

﹡袋裝容器的封口：用無棉蓋體封口、擰口、折口等。二、培養料的滅菌●常壓蒸氣滅菌●高壓蒸氣滅菌●滅菌效果的檢驗●常壓蒸氣滅菌

當低層培養料的溫度達到100℃時，保持8～12h，培養料內的雜菌已被徹底殺死。●高壓蒸氣滅菌

在121～128℃、0.11～0.14MPa下，木屑、棉耔殼培養料保持1～1.5h，谷粒培養料則需2.0～2.5h。●滅菌效果的檢驗

隨機抽樣，置于25～30℃的條件下，培養3～5d，若沒有雜菌長出，說明滅菌徹底。

第二節接種與培養一、接種設備的使用規程二、二級菌種和三級菌種的接種三、二級菌種和三級菌種的培養

一、接種設備的使用規程●接種室使用規程●超凈工作臺使用規程●接種箱（室）的雜菌檢查●接種室使用規程

1.使用前半小時，把所需物品搬入接種場所噴霧消毒，關閉門窗，開啟紫外線燈照射0.5h。

2.穿上工作服和鞋，戴好口罩、帽，用2％來蘇爾洗手。

3.操作前，用酒精棉球擦手。操作時，減少空氣波動。兩人操作時應配合默契，用完的廢棉球等應丟到廢物桶內。

4.接種結束及時收拾臺面，然后用石炭酸噴灑。

5.注意安全。如棉塞著火，用手緊握或用濕布撲滅，勿吹。若有帶菌物灑落，用抹布沾石炭酸，收拾到廢物桶內，用酒精棉球擦手后再繼續操作。●超凈工作臺使用規程1.把超凈工作臺用75％酒精擦凈。2.搬入培養料和菌種。3.接種工具事先高溫滅菌備用。雙手用酒精棉球擦凈。4.開動機器約20min后，接種區空氣凈化完成，即可接種。

5.操作時，動作輕盈，頭、手盡量置于接種材料的下風側，接種用具放在臺面兩側。

6.接種結束，移去接種材料，再停止運轉。7.如經常使用，每2～3個月檢查一次空氣的無菌程度。如不合標準，應及時更換超細纖維過濾板。●接種箱（室）的雜菌檢查1.制備6支PDA或牛肉膏的斜面或平板。

2.斜面打開棉塞，直立放置0.5h。培養皿開蓋5min，并在接種過程中和接種完畢時，進行同樣檢查。寫明標簽，檢查熏蒸、噴霧消毒藥液及紫外線燈光殺菌的效果。3.將檢查的6支斜面或6個培養皿，置于30℃下培養48h，檢查菌落生長數。

4.平板內≤3個菌落，斜面上無菌落的為合格。否則為污染嚴重。霉菌多時，用石炭酸噴霧后用甲醛熏蒸。如細菌多，可用乳酸和甲醛交替熏蒸。二、二級菌種和三級菌種的接種●接種的無菌操作規程●二級菌種的接種●三級菌種的接種●塑料袋接種●幾種簡易的接種方法●接種的無菌操作規程

1.按種空間徹底滅菌。凡是菌種所暴露的部位或通過的空間，都必須是無菌區。

2.酒精燈火焰封口(瓶口或管口)。3.接種工具灼燒后冷卻，再取菌種，所取菌種不得在火焰旁停留，也不要通過火焰，以免菌種燒傷。4.封口物，不要隨便放在臺面上,管口或瓶口不得和其他物體接觸。5.接種工具徹底灼燒滅菌（包括進入試管的其他部位）。

6.接種過程中，管口或瓶口，應立即燒灼，以燒死多數雜菌。在操作時，試管口或瓶口不得離開火焰附近，在無菌區即可。7.燒灼的接種工具冷卻后，取少許菌種迅速抽出。注意不要碰到管、瓶壁，取出時不可通過火焰，以免燒死菌絲。8.

將取出的菌種迅速送入待接袋(或)內培養料的孔內。

9.抽出接種工具，將管口(或瓶口)在火焰上燒灼，立即封口。●二級菌種的接種

把試管菌種接入二級菌種培養料中的過程稱為二級菌種接種。二級種要求純度高、質量好。●二級菌種的接種

﹡接種前的準備

﹡二級菌種的接種﹡接種前的準備

1.一級種選擇：選擇種性純正，健壯、濃密、整齊的一級種。2.接種箱(室)消毒：用84噴灑后再開紫外燈20min。用酒精棉球擦管（瓶）外面，管口、瓶口和棉塞都要在火焰上烘烤。一點接種

切取2㎝菌種，迅速送入菌種瓶內的接種穴上，立即封口。每支一級菌種可接5～8瓶二級種。

兩點接種

先在接種穴內放一塊菌種，后在接種穴口上放一塊菌種。每支斜面菌種可接二級菌種3～5瓶。接種箱、超凈臺接種箱、超凈臺接種箱、超凈臺●三級菌種的接種

把二級菌種接入三級菌種培養料中的過程稱為三級菌種接種。三級菌種用玻璃瓶或塑料袋生產。●三級菌種的接種﹡接種前的準備﹡三級菌種的接種﹡塑料袋接種﹡幾種簡易的接種方法﹡接種前的準備

把所需物品搬入接種箱(室)中，將二級種橫置于接種架上，待接種的料瓶(袋)臥放。然后對接種場所進行消毒處理。﹡三級菌種的接種

用酒精棉球擦拭瓶外壁，以火焰瓶口。夾取燃著的酒精棉球，燒灼二級種瓶口、瓶頸內壁，進行瓶口消毒。用灼燒后的鑷子扒去老菌皮，搗碎菌料，火焰封口，放在接種瓶架上。

單人操作時，左手執料瓶，右手拔去棉塞用小指和手掌夾住，掀起封口紙一個小角。右手執接種工具，灼燒后，取2㎝大小原種塊。迅速投入料瓶內。一般每瓶二級種可接40～80瓶三級種。﹡三級菌種的接種﹡塑料袋接種

由于塑料袋質軟，袋口不能直立，又不能接近火焰，操作不不埂。最好在無菌條件較好的接種箱(帳)內接種。接種時采用單人或雙人操作法進行接種。﹡幾種簡易的接種方法1.蒸氣接種法2.電爐接種法3.扇形多頭酒精燈接種法

1.蒸氣接種法⑴原理⑵方法⑴原理

需要小接種室和一套蒸氣發生器。電爐上放一鋁鍋，作為蒸氣發生器，在鍋蓋中央挖一個直徑10厘米的圓孔，蒸氣在圓孔內集中向外擴散，把含有雜菌的空氣排開，形成無菌區。⑵方法

接種前，向空中噴水，使空中孢子隨水滴沉降。將培養料趁熱搬進接種室，待料溫降至30℃以下時開始接種。在此之前將水燒開，把接種工具等放入水中煮沸15分鐘、然后即可接種。

兩人配合，一人左手握菌種瓶(或管)，右手拿接種工具，負責將菌種接入待接的瓶、袋內，另一人將待接的瓶、袋開塞或開口，接入菌種后立即封口。菌種瓶口、接種工具，待接瓶口(或袋口)及棉塞，不得離開蒸氣，以免感染雜菌。瓶口要稍向下傾斜。兩人接種，一次可接500～800瓶。2.電爐接種法

800～1000瓦電爐，用薄鐵皮做一個內徑30～50㎝，高40～60㎝的圓筒，罩在電爐外即成。這樣熱流集中于筒頂口形成一個無菌區，其范圍和熱力遠遠超過酒精燈火焰。一套設備可供3～4人同時操作。操作時，盡可能縮短時間，以避免燙死菌絲。三、二級菌種和三級菌種的培養

需放置在適宜的環境條件下進行培養。菌種的培養實質是對菌絲體的培養。三、二級菌種和三級菌種的培養●培養的重點工作●出現的異常現象●培養的重點工作

1.二級種、三級種接種后，及時移入徹底處理過的培養室內培養，溫度調致23～25℃，空氣相對濕度65～70％。2.培養2～3d后檢查雜菌。發現有污染的立即取出。開始每天檢查一次，當菌絲覆蓋培養料，并吃料1～2㎝時，每周檢查一次。

3.檢查溫度變化。當菌絲快滿瓶（袋）時，將培養溫度降低2～3℃，起到壯菌的作用。4.培養3～5d后檢查成活率。發現菌種塊沒有萌發的，應剔出單獨放，一周后仍未萌發，要及時進行補種。5.培養室要保持空氣新鮮、清潔、遮光，濕度過大時，要進行通風。

6.殺菌、殺蟲、防鼠工作，貫徹始終。

7.菌種(特別是二級菌種)培養好后，及時使用。二級菌種滿瓶后7～10d，菌絲處于快速生長期，適應性較強。三級菌種培育好后，要置于低溫、干燥、清潔的室內避光保存一個月。●菌種培養中出現的異常現象

培養二級種和三級種時，若能選擇優良菌種、合理配方、優質原料、嚴格滅菌、遵循無菌操作規程和科學培育，可培養出優良的二級種和三級種。但因種種因素，會出現異常現象，如雜菌污染、菌絲不萌發、不生長或菌絲發生萎縮衰退等現象。●出現異常現象的處理◆雜菌污染◆斷菌◆退菌◆菌絲徒長◆不吃料◆雜菌污染◆雜菌污染◆雜菌污染◆雜菌污染◆雜菌污染◆雜菌污染﹡雜菌污染的原因﹡防止雜菌污染措施﹡雜菌污染的原因

1.如果雜菌在培養料的上、中、下部位同時發生。是由于培養料滅菌不徹底造成的。2.如果雜菌開始發生在接種塊上。是母種或原種已被污染，或者是由于接種工具滅菌不徹底造成。3.如果雜菌先在培養基表面發生。由于接種過程中無菌操作不嚴格引起的。

4.如果雜菌在接種若干天后才發生，并首先發生在從瓶口往下生長的菌絲上，說明是從棉塞侵入培養料的。是培養室濕度過大，棉塞受潮，造成霉菌滋生所致。﹡防止雜菌污染措施

1.搞好環境衛生。制種人員必須建立起正常的清潔衛生制度，不斷清除污物，并加以藥劑消毒，不讓雜菌有滋生的余地。2.處理好原料。嚴加管理，杜絕任其堆放原料，不加保護，上下受潮霉變、中間生蟲、骯臟不堪的現象。

3.調整含水量和酸堿度。培養料的水分適當，酸堿度適宜，則發菌順利，不易生雜菌。常見的毛病是；用水不稱也不量，酸堿度不測更無調節。4.保護培養料。滅過菌的培養料應該加以保護。以為滅過菌，馬虎了事，不遮不蓋，污染嚴重。

5.嚴格遵守無菌操作規程。要耐心、細致，切忌碰擦粘帶。

問題：器械不洗依靠熏，不擦酒精依靠熏，擦了酒精就不用火焰燒，碰擦污物不重燒等。正確作法

接種的用具、容器，能洗的要洗干凈，能熏的要熏蒸，能擦酒精的要擦酒精，能用酒精燈火焰燒的要用火焰燒。大量的三級種可兩人接種，把好火焰封鎖關，一人持料瓶，一人接種，不離火焰無菌區，配合默契，動作敏捷。◆不吃料現象

接入菌種瓶內的母種或原種，菌絲不萌發；有些菌種塊上的菌絲雖萌發，但不向料內生長，以后逐漸萎縮變黃。產生原因

1.培養料配方不合理，配制不科學。

2.培養料含水量、pH不適合，菌絲不吃料。

3.接種場所處理時，用藥量過多或溫度過高，致使菌絲受藥害死亡。

4.滅菌以后，搶溫接種溫度過高，致使菌絲遇高溫而死亡。

5.接種工具未冷卻或菌絲塊靠火焰太近，菌絲被燙死或燒死。

6.接入的母種或原種，在不條件下長期儲藏，菌絲老化失去生長能力。

7.菌種瓶（袋）內潛入螨類，咬食菌種塊，致使菌絲消失。

第四節液體菌種生產和使用液體菌種：在無菌條件下，將母種接種于合適的液體培養基中，給予適宜的條件，通過震蕩、攪拌等方式培養出來的菌絲球稱為液體菌種。第四節液體菌種生產和使用一、液體菌種的優點二、液體菌種培養液配方三、液體菌種的培養四、液體菌種的使用一、液體菌種的優點●菌種生產周期短●接于固體料中發菌快●菌齡整齊一致●接種方便二、液體菌種培養液配方

1.葡萄糖30％，豆餅粉2％，玉米粉1％，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％，碳酸鈣0.2％，硫酸鎂0.05％，pH自然。適于多種食用菌的液體培養。

2.可溶性淀粉3～6％、蔗糖1％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，酵母膏0.1％，pH值調至6。適于平菇、香菇、猴頭菇，以平菇最為適宜。可溶性淀盼可增加培養液粘度，菌絲球小而多，菌絲球分散性好。

3.馬鈴薯20％，葡萄糖2％，硫酸銨0.2％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，維生素B110毫克/升，瓊脂0.05％，pH自然。適于培養香菇，菌絲生長快、菌球大、多，周圍有絨毛，絨毛狀菌普遍存在培養液中，有利于播種。

4.玉米粉4％，水解魚粉2％，酵母膏0.1％，磷酸二氫鉀0.15％，硫酸鎂0.05％，pH自然。適于培養金針菇，猴頭菌。

5.葡萄糖2.5％，酵母膏0.35％，玉米漿(含氮量7.1％)0.18％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.006％，每升培養液內另加硫酸鋅4毫克，硫酸錳5毫克，檸檬酸鐵5毫克，維生素B10.1毫克。適于培養茯苓。三、液體菌種的培養

液體菌種的培養：采用搖床生產的搖瓶培養法和采用發酵罐生產的深層培養法。●液體菌種的搖瓶培養

搖床室溫在24～26℃，培養72～96h。培養結束時，因菌種不同，培養液出現不同色澤。平菇，金針菇的培養液呈淺黃色，香菇、猴頭菌的培養液呈黃棕色，清澈透明，有許多菌絲小球，并有菇香。木耳的培養液呈褐色、粘稠，有香甜味。培養液混濁，多是細菌污染。培養液經顯微鏡檢查后。方可用于生產。

搖床培養，只適于固體菌種的接種。液體菌種供發酵罐接種，或接種于三角瓶內，每瓶接種10mL，繼續搖瓶培養。因菌球正處于旺盛生長狀態，分散性好，能縮短培養時間，快者2d即可終止培養。搖瓶培養的液體菌種，在4℃冰箱中保存1—2個月，在15～20℃室溫中保存7～10天，對接種成功率，產量均無不良影響。搖瓶培養的液體菌種●液體菌種的深層發酵培養