第四節(jié)基因重組與遺傳育種8.4.1基因重組8.4.2細菌的轉(zhuǎn)化8.4.3細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)8.4.4細菌的接合8.4.5基于基因重組的遺傳育種方式8.4.1基因重組兩個DNA分子之間發(fā)生分子水平上的重新組合，產(chǎn)生具有不同核苷酸序列的新的DNA分子，這一過程叫做基因重組；位點專一性重組同源重組轉(zhuǎn)座重組不正常重組同源序列：堿基序列相似的兩段DNA序列；同源重組：兩個具有同源序列的DNA之間發(fā)生相互性或非相互性交換重組；同源重組過程：DNA解鏈、單鏈斷裂、配對、重接形成異源雙鏈區(qū)，然后經(jīng)DNA復(fù)制而純化；配對重接斷裂異源雙鏈解鏈斷裂同源重組的過程有性繁殖期間，兩個性細胞質(zhì)配、核配形成二倍體合子，此時，親代的兩個染色體相遇，并發(fā)生一定頻率的基因重組，使減數(shù)分裂產(chǎn)生的子代的基因組具有親代的特性；基因重組在具有性繁殖的生物中是普遍存在的現(xiàn)象，有利于基因多樣性；有性繁殖與同源重組原核生物的基因重組原核生物缺乏有性繁殖，基因重組并不普遍存在，相對頻繁的基因突變，是基因多樣性的來源；原核生物中存在幾種特殊的基因水平轉(zhuǎn)移方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合；在一定條件下，這幾種基因水平轉(zhuǎn)移方式，能夠?qū)е略松镏g發(fā)生基因重組；通過上述方式發(fā)生基因重組，而形成的具有新的基因型的細胞，稱為重組子；8.4.2細菌的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（competencecell）：某些微生物在特定環(huán)境條件下出現(xiàn)的，能夠?qū)釪NA片段吸收進入細胞的一種特殊生理狀態(tài)；肺炎雙球菌、芽孢桿菌、假單胞菌、大腸桿菌等細菌具有感受態(tài)；真核的釀酒酵母等能夠形成感受態(tài)；轉(zhuǎn)化（transformation）：感受態(tài)細胞吸收外源DNA進入細胞，而發(fā)生基因重組的過程；通過轉(zhuǎn)化而形成的重組子，也稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）；轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的形成感受態(tài)細胞吸收的外源DNA，如果與自身染色體具有同源性，就有一定的幾率發(fā)生同源重組，產(chǎn)生雜合的DNA區(qū)域；當(dāng)DNA復(fù)制時，產(chǎn)生純合的新型子代DNA；細胞分裂時，新型子代DNA進入子細胞，形成的具有新的基因型的轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)染（transfection）和廣義的轉(zhuǎn)化用提純的噬菌體DNA，通過轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入宿主細胞，結(jié)果產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒，稱為轉(zhuǎn)染；廣義的轉(zhuǎn)化：將游離DNA片段或質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細胞的技術(shù)手段，是基因工程的基本方法之一：人工感受態(tài)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化：擊穿細胞壁和細胞膜8.4.3細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：通過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，借助噬菌體的感染能力，將外源DNA導(dǎo)入受體細胞，而發(fā)生基因重組的方式；轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體：噬菌體衣殼內(nèi)全部為外源DNA的完全缺陷型噬菌體，或者衣殼內(nèi)帶有部分外源DNA的部分缺陷型噬菌體；完全缺陷型噬菌體的形成子代噬菌體在宿主細胞內(nèi)裝配時，因“誤切”和“誤包”而將宿主的DNA片段裝進噬菌體衣殼，形成只含宿主DNA片段的完全缺陷型噬菌體；完全缺陷型噬菌體既可以由烈性噬菌體形成，也可由溫和性噬菌體形成，自然形成幾率約10-6～10-8；部分缺陷型噬菌體的形成整合在溶源化細胞染色體上的原噬菌體，去整合化時可能發(fā)生“誤切”，自身部分DNA與旁側(cè)的染色體發(fā)生了交換而切割下來，形成部分缺陷的噬菌體核酸；部分缺陷的噬菌體核酸仍然能夠正常復(fù)制和基因表達，并裝配、裂解宿主細胞，產(chǎn)生部分缺陷型的子代噬菌體；幾率低于10-6；完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)完全缺陷型噬菌體感染另外的宿主細胞，而將來自供體菌的一段外源DNA轉(zhuǎn)入受體菌；如果外源DNA與宿主染色體發(fā)生了基因重組，則形成具有新基因型的重組子，叫做轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant），這種基因重組形成重組子的方式，稱為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)；由于完全缺陷型噬菌體能將供體菌的任何一段DNA轉(zhuǎn)入受體菌，由此而發(fā)生基因重組，形成重組子的方式，也稱完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)；普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它結(jié)果如果由完全缺陷型噬菌體轉(zhuǎn)入的供體菌DNA片段，沒有發(fā)生基因重組，而被受體菌降解，則稱為為轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗；如果轉(zhuǎn)入的DNA片段不能與宿主染色體發(fā)生基因重組，也沒有被降解，而是存在于受體菌中，稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)；局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)由部分缺陷型噬菌體感染受體菌，將來自供體菌染色體特定位點的核酸片段轉(zhuǎn)入受體菌，如果發(fā)生基因重組，則形成具有新的基因型的轉(zhuǎn)導(dǎo)子；由于部分缺陷型噬菌體只能將供體菌特定的染色體片段（原噬菌體整合位點的旁側(cè)基因）轉(zhuǎn)入受體菌，因此，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)；E.colil噬菌體介導(dǎo)的局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)在溶源菌的誘發(fā)裂解物中，部分缺陷型噬菌體的含量極低（低于10-9），稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物；用這種低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，在低感染復(fù)數(shù)下進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，只能得到極少量的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)；感染復(fù)數(shù)（m.o.i）：用噬菌體感染宿主時，所用噬菌體的數(shù)量與宿主細胞數(shù)量的比值；高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)用高感染復(fù)數(shù)的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物感染受體菌，可能分離出既被正常噬菌體感染，同時又被部分缺陷型噬菌體感染的雙重溶源化細胞；誘發(fā)裂解雙重溶源化細胞，正常噬菌體與部分缺陷型噬菌體同樣增殖，形成部分缺陷噬菌體含量占50％的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物；用高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物感染受體菌，能夠高頻率的得到轉(zhuǎn)導(dǎo)子，為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)；8.4.4細菌的接合“雄性”（F+）菌株：指帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（F質(zhì)粒）的大腸桿菌菌株，長有幾根性菌毛；“雌性”（F-）菌株：不帶轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，沒有性菌毛的大腸桿菌株；接合（conjugation）：F+與F-菌株通過中空的性菌毛連接，并將F質(zhì)粒的拷貝轉(zhuǎn)移給F-菌株，使F-也變成F+菌株的生理過程；Hfr菌株與F-菌株的接合Hfr與F-接合后，整合的F質(zhì)粒從oriT位點斷開，一條單鏈通過性菌毛開始向F－轉(zhuǎn)移；同時環(huán)狀單鏈為模板，進行滾環(huán)復(fù)制；位于oriT位點后的宿主染色體最先跟隨oriT向F-轉(zhuǎn)移；F質(zhì)粒整合到宿主染色體上的菌株，稱為高頻重組（Hfr）菌株，其表型與F＋完全一致；中斷雜交在自然條件下，DNA轉(zhuǎn)移過程受環(huán)境因素干擾，隨時可能終止，完整的轉(zhuǎn)移需要100分鐘，常出現(xiàn)不同轉(zhuǎn)移時間的中斷雜交；中斷雜交使Hfr菌株的部分染色體轉(zhuǎn)移到F－中；接合子的產(chǎn)生Hfr菌株與F-菌株接合能夠高頻率的將供體菌的部分DNA轉(zhuǎn)移到受體菌中；同時，供體DNA與受體菌DNA之間同源性很高，能夠高頻率的發(fā)生基因重組，產(chǎn)生具有新基因型的接合子；

F′質(zhì)粒的性導(dǎo)F質(zhì)粒從染色體上切離時，可能發(fā)生“誤切”，形成帶有一段宿主DNA的質(zhì)粒，叫做初生F′質(zhì)粒；初生F′菌株仍具有F+菌株的所有表型，與F－接合后，初生F′質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到F-菌株中，形成帶有次生F′質(zhì)粒的F′菌株；次生F′質(zhì)粒帶有的供體菌DNA，如果與受體菌染色體發(fā)生基因重組，則產(chǎn)生重組子，這種基因重組方式稱為F質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，或性導(dǎo)；第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏菌種的衰退與復(fù)壯菌種的衰退：對于產(chǎn)量突變型而言，由于自發(fā)突變，以及培養(yǎng)條件的選擇作用，使得回復(fù)突變株逐漸積累，當(dāng)達到一定數(shù)量時，菌種的產(chǎn)量性狀開始下降；菌種的復(fù)壯：從已出現(xiàn)衰退的細胞群體中，把未發(fā)生回復(fù)突變的原種分離出來，恢復(fù)原種的典型性狀；防止衰退的措施：采用使細胞徹底休眠的長期菌種保藏方法，減少自發(fā)突變幾率；短期保藏的菌種，在使用中要盡量減少傳代次數(shù)，并定期進行純種分離；

菌種的保藏菌種保藏目的：使微生物菌種短期或長期存活，不因衰老而死亡、不因突變而變異、不因染菌而混雜；菌種保藏的原理：在不損傷細胞的前提下，使細胞或孢子因缺乏一種或多種必要的生長（萌發(fā)）條件而處于緩慢代謝的半休眠或徹底休眠的狀態(tài)：缺乏或無營養(yǎng)、低溫（低于最低生長溫度）、超低溫、隔絕空氣（無氧）、干燥（水活度遠低于生長要求）；

超低溫條件對細胞的損傷及保護低于0℃時，水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶，會刺破細胞膜；當(dāng)溫度回升而解凍時，細胞死亡；使用低于0℃的條件保藏菌種時，需使用保護劑防止冰晶的生成，及保護細胞膜；常用保護劑：甘油、二甲亞砜、脫脂牛奶、海藻糖、血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮等；菌種短期保藏法低溫保藏法：健壯的平板或斜面培養(yǎng)物，置于0℃～4℃冰箱內(nèi)，可保藏約3個月左右；因細胞沒有徹底休眠，及水分逐漸蒸發(fā)而影響保藏期；石蠟油封低溫保藏法：在斜面培養(yǎng)物的試管中加入惰性的滅菌石蠟油，防止水分蒸發(fā)，置于0℃～4℃冰箱內(nèi)，可有限延長保藏時間；適用于大多數(shù)嗜中溫微生物和嗜熱微生物的保藏；菌種長期保藏法超低溫保藏法：用于營養(yǎng)細胞保藏；細胞懸液加保護劑，置-70℃～-80℃（超低溫冰箱）或-196℃（液氮罐）保藏數(shù)年；冷凍真空干燥保藏法：用于營養(yǎng)細胞保藏；細胞懸液加保護劑，速凍，真空干燥脫水，細胞干粉密封在安瓿管，于4℃~-20℃（普通冰箱）保藏數(shù)年；沙土管干燥保藏法：用于孢子保藏；孢子懸液與細砂土顆粒混合，充分干燥后密封于安瓿管，保