中國漢族人食管鱗狀細胞癌

易感基因定位研究

周福有王立東

河南省安陽市腫瘤醫院胸外科河南省食管癌重點開放實驗室2010.10.31鄭州河南省林縣、安陽、新鄉等顯著的地域分布差異

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，每年死亡30萬人，也是中國最常見的惡性腫瘤，排在中國惡性腫瘤死因的第四位有顯著的地域分布特征，高低發區發病率相差高達500倍楊氏家族家庭成員:23,食管癌患者:15(65%)明顯的家族聚集現象高癌家族林縣1965年高癌家族林縣2007年環境因素復雜遺傳因素明顯食管癌的病因尚不清楚

遺傳因素？

環境因素？問題：遺傳因素和環境因素究竟孰重孰輕？相互之間如何起作用？單基因遺傳病單基因遺傳病是指單一基因突變引起的疾病符合孟德爾遺傳方式，所以稱孟德爾式遺傳病多基因遺傳病多基因遺傳病是由多個微效基因與環境因素共同作用所致,遺傳方式不遵循孟德爾遺傳模式癌癥

糖尿病

高血壓

冠心病

精神分裂癥

……2003年1953年遺傳學研究的三大里程碑

人類基因組研究第一次浪潮

2005年多國參與的合作項目構建不同人群的高密度SNP圖譜確立SNP在人群中的常見分布和傳遞模式每1000個堿基對中有1個SNP,個體遺傳信息有99.9%是相同，差異0.1%。發現與這些差異可以了解常見疾病相關基因為揭示人類的遺傳機制，發現常見疾病相關基因提供方向；為發現復雜疾病易感基因提供基礎數據、研究策略和先進技術人類基因組單體型圖計劃（HapMap計劃）

GWAS基于“常見疾病，常見突變”學說，通過整個人類基因組來尋找常見遺傳變異的可見性狀間關系的研究方法全基因組關聯分析(GWAS)?GWAS原理

ATGCAAGCTGATCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGCATGCAAGCTGTTCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGC病例對照原理：在一定人群中，某個等位基因或基因型在病例和對照組中存在差異，說明它與疾病有關聯性病例對照

在病例中等位基因C的頻率明顯高于對照提示：等位基因C與疾病存在一定關聯性55%35%45%65%30.25%12.25%20.25%42.25%45.5%49.5%GWAS舉例

全基因組關聯分析GenomewideassociationstudyGWAS優勢GWAS癌癥研究(NG,2008-)已完成或正進行：乳腺、前列腺、肺、結直腸癌、黑色素瘤、睪丸生殖細胞腫瘤、胰腺、膀胱、腎臟、卵巢癌和造血系統腫瘤等食管癌：日本1篇小樣本文章尚無中國漢族人食管癌GWAS資料“863”計劃將對威脅我國人口健康的5類常見重大疾病：精神疾病、高血壓、糖尿病、食管癌和肺癌進行全基因組關聯分析研究。選擇tagSNPs標記單體型在病例-對照人群間比較SNPs等位基因頻率全基因組關聯統計分析，得出有意義的SNPs另外選擇獨立的病例-對照人群對初篩階段的結果進行驗證GWAS技術路線HapMap計劃初篩階段重復驗證階段利用芯片對所有tagSNPs進行基因分型研究對象中國漢族人群全部21496例初篩2810例（病例1077例/對照1733例）

驗證18686例（病例7673例/對照11013例）入組標準資料詳實完整病例/對照為同一地區自愿參加病例組無治療史病例組病理證實食管癌分期按UICC2007標準對照組三代親屬中無食管癌病例對照組經內鏡檢查除外早期食管癌不符合以上標準予以除外資料及血樣收集

45家醫院：全國范圍，華北為主問卷調查：統一格式采集外周靜脈血食管癌GWAS合作研究研討會2009.4.5-6安陽DNA提取及標化

QIAGEN（德國）基因組DNA提取試劑盒按標準程序提取每份血樣的DNA準確測定每份待標化DNA的濃度初篩濃度：50ng/μl，OD值1.8-2.0

驗證濃度：15ng-20ng/μl，OD值1.7-2.0基因分型和質控

初篩：IlluminaHuman610-Quad芯片驗證：SequenomiPLEX

芯片具體步驟：（6）清潔芯片（7）染色（8）芯片掃描（9）數據質控（1）制備MSA1板（2）片段化（3）沉淀（4）重懸（5）雜交優勢技術：綜合了BeadArray高密度微陣列技術和GoldenGate多通道位點特異性延伸擴增檢測方案通量：一次分型的SNP位點達到55萬－60萬,同時可以定制自己感興趣的位點Illumina分型芯片統計學分析數據質控：計算樣本得率、SNP得率、最小等位基因頻率、哈迪·溫伯格遺傳平衡吻合度檢驗對質控后的數據用Plink1.03軟件分析Cochran-Armitage趨勢檢驗：計算P值、優勢比（OR）和95%可信區間（95%CI）初篩

50萬個SNPS

病例1077

病例937對照1733

對照692趨勢檢驗

進入初篩去除不匹配者

80個SNPS

18個SNPS

2個SNPS

全基因組曼哈頓圖

（937病例/692對照）選點選點18個SNPS2個SNPS

病例7673例/對照11013例

rs2274223rs13042395驗證研究了在目標SNP和基因位點處相關區域的重組和鏈鎖不平衡類型兩個易感基因分別定位

phospholipaseCepsilon1(PLCE1),10q23

chromosome20openingreadingframe54(C20orf54),20p13基因定位兩個易感基因和腫瘤密切相關PLCE1（磷脂酶基因亞運型）對多種惡性腫瘤的發生、發展、轉移有促進作用C20orf54（核黃素轉運基因）調節人類核黃素的轉運，而核黃素缺乏是增加食管鱗狀細胞癌發生的重要風險因子PLCE1蛋白表達在不同病變組織差異顯著0102030405060708090正常組織食管鱗癌癌前病變%P=2.08E-13陽性陰性結果提示免疫組化發現隨食管癌變過程的進展，即正常→癌前病變→浸潤癌各級組織中PLCE1蛋白陽性表達率逐漸升高

進一步提示：PLCE1的遺傳變異在食管癌變過程中起重要作用，PLCE1可能是中國漢族人食管鱗狀細胞癌的致病基因食管癌變各階段免疫組化染色DYSNORCISSCC王立東，周福有，等ADH1B位于4q21-23ALDH2位于12q24兩個基因都與酒精代謝有關日本食管鱗癌GWAS結果增加食管鱗癌發病風險下一步工作計劃增加樣本量，再篩出幾個易感基因將所發現的易感基因在世界各地樣品進行驗證，找出種族差異進行現場研究，用于食管癌早篩相關功能研究，靶向藥物的研制GWAS臨床應用GWAS重復驗證明確基因和基因產物確定功能開發基因靶向治療藥物開展個體化治療開發診