布病病原學及血清學123布氏菌的生物學特性布氏菌的抗原及毒力

布病實驗室檢驗主要內容1布魯氏菌的生物學特性

發現和分類位置31.1抵抗力31.3形態和培養特征1.2

1.1

布氏菌的發現及分類

布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細菌侵入機體，引起的傳染－變態反應性人畜共患傳染病，簡稱布病。

1887年英國軍醫Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。

微生物分類學家將布氏菌歸為布魯氏菌屬，下分

6個種19個生物型：

羊種布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型；牛種布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型；豬種布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型；沙林鼠種布氏菌（Br.neotemae）；綿羊附睪種布氏菌（Br.ovis）；犬種布氏菌（Br.canis）

2013年，我省共分離出3株布魯氏菌，均為羊3型；1991年以前流行優勢種型為羊1、2型，1996年后則為羊1、3型。陜西省是以羊型菌為主，牛、犬種布魯氏菌病的混合疫區，流行優勢種隨時間推移發生了變化。1.2形態和培養特征

布氏菌屬細菌是一組微小的球桿狀革蘭氏陰性菌，寬0.3～0.6μm，長0.6～1.5μm，可被所有的堿性染料所著色，吉姆薩染色成紫紅色；無芽孢、無鞭毛、無質粒、不形成莢膜。一般說來，羊種菌最小，牛種菌次之，豬種菌最大。鑒定布魯氏菌的染色方法是：A:革蘭氏染色B:復紅染色C:亞甲藍染色D:吉姆薩染色E:柯茲洛夫染色柯茲羅夫斯基提出用0.5%沙黃水溶液染色，加熱至出現水泡，水洗后用0.5%孔雀綠或1%煌綠或1%亞甲蘭水溶液復染1分鐘，布氏菌染成紅色，其他細菌染成綠色或藍色。

營養條件高，生長緩慢，生長所需溫度為20-40℃，最適溫度為37℃.通常要經過4-6天，有的甚至要經過20-30天（雙相培養基）才能長出菌落。1.3抵抗力對物理因子的抵抗力對化學因子的抵抗力不同環境中的抵抗能力對抗生素的敏感性不同溫度對布魯氏菌影響對物理因子的抵抗力布魯氏菌對消毒劑的抵抗能力對化學因子的抵抗力不同環境中的抵抗能力

現已證明，布魯氏菌對四環素最敏感，其次是鏈霉素，而對枯草桿菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很強的抵抗力。對抗生素的敏感性布氏菌的抗原、內毒素32.1布氏菌的毒力2.22布氏菌的抗原、毒力布氏菌的抗原成分十分復雜，存在A、M、G成分。A抗原對牛種布氏菌有特異性，M抗原對羊種布氏菌有特異性，G為兩種菌共有。與多種細菌存在共同抗原，因而有血清交叉反應。布氏菌不產生外毒素，只產生內毒素，有致熱、致炎作用，可導致休克。2.1布氏菌的抗原及內毒素

從種上來說，羊種毒力最強，豬種和牛種次之，犬種的毒力很弱，幾乎不引起人致病。由于菌種毒力等因素的不同，患病后的臨床表現也不完全一樣。羊種布魯氏菌患者中毒癥狀嚴重，多有典型的發燒、多汗、頭痛、虛弱、關節痛、肝脾及睪丸腫大等急性癥狀。2.2布氏菌的毒力2.3布病發病過程細菌學檢驗33.1血清學檢驗3.23.布氏菌的實驗室檢驗實驗室要求：

布氏菌是高致病性病原微生物，從危害程度來說為第二類病原微生物。布氏菌的分離培養要在生物安全二級以上實驗室中進行。培養樣品采集培養菌株鑒定種型鑒定細菌學檢驗33.13.1.1布氏菌培養檢查材料：

人或動物的全血動物流產胎兒（胎兒的肝臟、肺、胃內容物）動物臟器、動物胎盤、關節液、陰道分泌物等新鮮乳汁3.1.2雙相血培養瓶采集對象：對急性期和慢性活動期病人未用藥前進行血液采集。采樣方法：

1.使培養瓶恢復至室溫、編號；

2.去掉培養瓶的保護帽，用酒精或碘消毒瓶塞；

3.用注射器無菌靜脈穿刺采集血液5mL，注入血培養瓶；4.再次消毒瓶塞和保護帽，蓋好保護帽；

5.從一側到一側傾斜培養瓶數次，混勻血液和肉湯。雙相血培養瓶培養方法1.將瓶子水平放置用肉湯沖洗瓊脂5-10分鐘以接種瓊脂；2.37℃直立培養。每隔一天觀察一次結果，如未長菌，可通過沖洗再接種一次。30天未出菌，可定為陰性，其血培養瓶經高壓滅菌處理；3.培養后觀察肉湯和瓊脂：出現下列一種或更多現象者為陽性結果：瓊脂上：出現菌落或產生氣體。肉湯中：出現渾濁、沉淀或溶血。3.1.3布氏菌培養特性生長緩慢，延滯期長，尤其初代分離需氧或微需氧菌，PH7.2，牛種部分型別、綿羊附睪種布氏菌需在5-10%CO2環境中培養菌落無色透明，光滑圓形，突起，均質，直徑1-2mm液體培養均勻混濁，無菌膜粗糙型菌落較大，生長快3.1.4分離培養基商用培養基：布氏瓊脂布氏肉湯制備培養基：肝浸液瓊脂血瓊脂培養基半固體培養基胰蛋白眎瓊脂培養基選擇性培養基：抗菌素和染料選擇性培養基桿菌肽放線菌酮制霉菌素布氏菌特異的油滴樣菌落布氏瓊脂布魯氏菌菌落血平皿布氏菌菌落布氏菌革蘭氏染色3.1.5布氏菌菌株鑒定布氏菌診斷血清凝集試驗H2S產生試驗，CO2培養依賴試驗染料抑菌試驗(硫堇，堿性復紅)單項特異性血清A、M凝集試驗粗糙型（R）血清凝集試驗噬菌體裂解試驗PCR檢測其他方法檢測生化測定脂肪酸分析PFGE等3.1.6布氏菌噬菌體我國1981年起從國外引進布氏菌分型噬菌體，對鑒定布氏菌有良好使用價值，可以將布氏菌鑒定到種目前使用的噬菌體有

TbFiBK2WbRR/OR/C

噬菌體對布氏菌的裂解羊種布氏菌噬菌體裂解PCR檢測AMOS-PCR檢測方法提取DNA——PCR擴增——電泳血清學檢驗3.23.2.1診斷標準

（1）流行病學接觸史：密切接觸家畜、野生動物、畜產品、布氏菌培養物等或生活在疫區內的居民（2）臨床癥狀和體征（3）實驗室檢查：病原菌分離、試管凝集試驗、補體結合試驗、抗人球蛋白試驗

具備（1）、（2）和（3）項中的任何一項檢查陽性即可確定為布病病人3.2.2布氏菌的血清學診斷方法虎紅玻片凝集試驗(RBPT)試管凝集試驗(SAT)抗球蛋白試驗(Coomb`s試驗)含巰基化物處理血清后的凝集試驗（2ME試驗）補體結合試驗(CFT)乳環凝集試驗(MRT)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)金標法熒光偏振方法（FPA）虎紅玻片凝集實驗原理：利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性，主要檢查血清中的IgG類抗體。

評價：簡便快速、容易操作，適用于基層大面積檢疫，容易出現假陽性，結果僅供參考.方法：在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，5min之內觀察結果。結果判定：出現可見的凝集反應就判為陽性；否則就為陰性。注意事項：血清靜止的溫度和時間對實驗結果有很大的影響，在一定的時間和溫度范圍內，放置時間越長，溫度越高，假陽性率越低；患者空腹血清出現假陽性少；凡是試驗中凝集顆粒不規則，大小不勻，片狀或絮狀，凝集不清澈者，一般為假陽性，否則凝集顆粒規則，大小均勻，凝集清澈者，一般與SAT結果相符，為陽性。原理：布氏菌侵入機體后，就會刺激機體產生特異性抗體，其可與相應的抗原發生特異性結合，在電解質的作用下，就會形成肉眼可見的凝集反應，也就是用已知抗原查未知抗體。試管凝集試驗試管凝集試驗陰性陽性0.2ml血清2.3ml鹽水0.5ml抗原05ml棄去2.30.50.50.50.50.50.50.50.50.5ml鹽水1:1600比濁管的制備—++++++++++生理鹽水（ml）0.000.250.500.751.00稀釋抗原（ml）1.000.750.500.250.001.000.750.500.250.250.500.751.001.001.001.001.00結果判定：根據各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應程度（滴度），特別是50%清亮度（++）對判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定。++++液體完全透明，菌體成傘狀沉淀或塊狀顆粒狀沉淀，呈100%凝集。+++液體近于完全透明，菌體成傘狀沉淀，呈75%凝集。++液體略微透明，菌體呈較薄傘狀沉淀，呈50%凝集。+液體不透明，管底有很不明顯的傘狀沉淀，呈25%凝集。—液體不透明，無傘狀沉淀。效價以產生50%凝集的血清最高稀釋倍數為受檢血清的效價。血清對照為清亮透明無沉淀，抗原對照為均勻渾濁，兩種對照管成立，才可判定試驗管，否則重做。人的診斷標準：滴度1︰100及以上或病程一年以上者滴度為1︰50及以上為陽性試管凝集實驗的評價優點：特異好，實用性、敏感性強；主要檢查血清中的IgG和IgM，適合于急性期病人的診斷。缺點：有前帶現象，有時出現假陰性結果；產生一定的交叉反應；出結果慢，需要兩天注意事項受檢血清應新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10℃；采血后應于3-4日內進行檢查，因放置時間過長可能會導致血清效價降低；受檢血清靜置2h后再進行檢查；個別血清會出現前帶現象，建議多做幾個管，多采用幾個稀釋度。抗人球蛋白實驗（Coomb’s）原理：機體受布氏菌抗原刺激后可產生“完全抗體”和“不完全抗體”。不完全抗體可與相應抗原結合，但不出現可見反應。若將預測不完全抗體的人血清球蛋白作為抗原，注射于另一種動物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗體，再將此球蛋白抗體加入到抗原與不完全抗體復合體中，即可出現可見反應。分為兩個階段:①不完全抗體與相應抗原結合為不可見階段②抗原抗體復合物有抗球蛋白抗體凝集而形成可見反應

布氏菌感染后，約在15天出現不完全抗體，3個月左右達到高峰。可持續一年左右。該實驗可作為早期和追溯診斷。該試驗特異性較強，尤其適用于診斷亞急性和慢性病人，所查抗體主要為IgG、IgA類。一般不作為常規項目，在試管凝集試驗為可疑，患者又處于慢性期時，可考慮抗球蛋白試驗予以診斷。適用范圍

試管凝集試驗階段抗球蛋白反應階段：吸取上項試驗的可疑管和全部陰性管，4000轉/分離心15分鐘，反復洗滌3次。向各管中加入生理鹽水0.5ml，混勻，再向各管中加0.5ml一定稀釋度的抗球蛋白血清，將反應管置37℃溫箱中20-22小時，取出室溫放置2小時后判定結果。判定標準同試管凝集試驗方法對照被檢血清對照（被檢血清+鹽水）試管凝集抗原對照（試管抗原+鹽水）抗球蛋白血清加生理鹽水對照抗球蛋白血清加試管凝集抗原對照抗球蛋白血清加被檢血清對照對照全部為陰性時，實驗才有意義我國試行的用于診斷人布病標準1:400及以上滴度。注意事項在進行Coomb’s試驗時，洗滌抗原很重要，如不認真洗滌，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物質，會干擾下一步加入抗球蛋