男科實驗室檢查及質控臨床技術操作規范男性不育與精液（semen）質量密切相關，精液由精漿（seminalplasma）和精子（sperm）組成，在射精時由睪丸和附睪的分泌液及懸浮其中的精子與前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。精液分析是評估男性生育能力的重要方法，也是男科疾病診斷、療效觀察的實驗依據，但精液分析的各參數也不是特異的，它并不能夠確定到達受精位置的少數精子的受精能力，因此要正確地評價男性生育能力還需要結合臨床進行綜合評估（表16-1)。表16-1精液分析的正常參考值WH0第4版參考值WH0第5版參考值精液體積≥2.0ml≥1.5mlpH7.2-8.0≥7.2液化時間60min黏稠度精液液化后的拉絲≤2cm精子濃度≥20x106/ml≥15x106/ml精子活力a級精子25%,或a+b級精子50%PR≥32精子活動率≥60%PN+NP≥40%正常形態精子百分率≥15%≥4%精子存活率≥75%≥58%精漿中性葡糖苷酶35.1-87.7U/ml≥20mU/一次射精精漿果糖0.87-3.95g/L≥13/一次射精精漿鋅0.8-2.5mmol/L≥2.4umol/一次射精低滲膨脹率≥70%≥58%頂體完整率≥75%白細胞計數1x106/ml免疫珠試驗10%50%MAR試驗10%50%第一節精液標本采集一、精液采集前準備精液采集與分析必須嚴格按照標準化程序進行，才能提供受檢者的準確信息。精液采集規范化是做好精液分析的前提條件，在精液采集前應告知受檢者有關精液采集和運送的方法及注意事項。精液標本采集須禁欲2-7d。如需多次采集標本，每次禁欲天數盡可能一致。精液標本采集必須完整，如果標本不完整，受檢者要報告精液標本任何部分的丟失情況，尤其是含精子濃度最高的初始部分精液，以免影響精子濃度的測定，并在報告中注明。由于精液分析受多種因素的影響，不能憑一次的精液結果作出判斷，應間隔1-2周進行2次或3次以上的分析。如果兩次的結果有明顯的差異，應再進行分析。二、精液標本的采集方法1.采集精液推薦使用手淫采集，如有困難可用儀器輔助。用對精子無毒性作用的廣口玻璃杯或塑料容器收集精液，溫度保持在25-37℃，以避免降低精子活力。精液采集一定要完全，不完整的精液不宜進行分析。2.禁用性交中斷法采集精液，這種方法容易造成丟失精液的前一部分。如手淫取精有困難，可用特制的避孕套進行精液采集，不能用市售乳膠或塑料制品的避孕套，因為避孕套內含有殺精劑。3.為避免精液暴露于溫度波動的環境和控制從采集到檢測的時間，安排靠近實驗室的私密房間采集標本。推薦用手淫的方法采集精液，取精前洗凈雙手和陰莖。充分勃起陰莖并盡量興奮，將精液全部射人指定容器中，如確有困難可選擇以下方法進行:家中樣本采集;避孕套采集，只能用經特殊設計對精子沒有毒性的避孕套來采樣。以上受檢者應記錄采集的時間，并在1h內送至實驗室。在送至實驗室途中樣本應保持在20-37℃的環境中。4.進行微生物檢測精液樣本的采集:須避免來自精液以外的污染，受檢者需按下列步驟進行:排尿;用肥皂清洗手和陰莖;沖去殘留肥皂;用無菌毛巾擦手和陰莖;精液射人無菌容器中。精液樣本的收集至實驗室微生物操作開始的時間不超過3h。淋球菌對溫度和氧氣敏感，精液標本應在20min之內檢查。5.精液標本采集后記錄采集時間，并注明患者姓名、采集日期和時間、禁欲時間、標本采集是否完整、標本采集過程中的困難以及標本從采集到分析的時間間隔等，標本應盡量在1h內檢測，一定不能超過2小時檢測，液化時間觀察應在精液標本采集后就開始。精液標本采集后在實驗室存放或在轉送過程中，其溫度應保持在25-37℃，溫度過高或過低都會影響精子活力。6.生物安全:精液是潛在的傳染源，精液標本應視為生物危險品，其可能含有有害的感染物質，如HIV、HBV、HsV等，操作者應注意自身安全防護。第二節精液常規分析精液常規檢查包括精液體積、液化時間、酸堿度、黏稠度、精子濃度、活力和活率分析等。一、精液外觀剛射出的精液通常為灰白或淡黃色，自行液化后為半透明乳白色或淡黃色的均質、半流體液體。長時間未排精的精液為淡黃色或暗黃色，黃疸患者和服用維生素或某些藥物者的精液可呈黃色。藥物可使精液帶有顏色。如果混有大量紅細胞顏色可為紅色，稱為血精，常見于精囊炎、前列腺炎等生殖系統疾病，也可見于苗勒管囊腫、結石、腫瘤如前列腺癌、輸精管的微小損害等。二、精液體積WH0推薦稱重法和直接測量法進行精液體積測定，首選稱重法，精液的密度變化范圍大致在1.043-1.102g/ml。不推薦使用目測法檢測精液體積。三、液化時間精液射出后很快呈典型的半固體凝膠團塊，通常在幾分鐘內便開始液化，通常室溫15min內精液標本可完全液化，很少超過60min。超過60min未液化，稱為精液遲緩液化或精液液化異常。不液化精液按如下方法處理。1.加人等體積的Dulbeco磷酸緩沖液，并反復吹打，可使某些精液標本液化。Dulbeco磷酸鹽緩沖液配制:①Dulbeco葡萄糖-PBs:0.2g氯化鉀（KCl)、0.2g磷酸二氫鉀 （KH2P04)、0.1g氯化鎂（MgCl2.6H20)、8.0g氯化鈉（NaCl)、2.16g磷酸氫二鈉（Na2HP04.7H20)和1.0gD-葡萄糖加人到750ml蒸餾水中。②將0.132g氯化鈣（CaCl2.2H20）溶于10ml蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加人上述溶液中。③用1mol/LNa0H調節pH至7.4。④用蒸餾水定容至1000ml。2.精液反復緩慢地通過接在注射器上的18號或19號鈍性針頭，可降低精液的非均勻狀態。3.應用廣譜蛋白水解酶—菠蘿蛋白酶消化，有助于促進精液液化。以上處理可能影響精漿生化、精子活力和精子形態分析，應記錄相應操作。精液液化不全常見于前列腺疾病，特別是與前列腺炎有關。四、pH推薦使用精密pH試紙檢測，在精液液化后立即測定，精液放置時間長會影響pH測定。將一滴混勻的精液在pH精密試紙上均勻展開，待浸漬區顏色變得均勻（30s內)，讀取pH。五、黏稠度用滴管吸人精液或玻棒插入精液，讓精液依靠自身重力滴落并觀察拉絲的長度，正常精液形成不連續的小滴，拉絲長度大于2cm視為異常。黏稠度增加處理方法同液化不全。六、精子凝集精子凝集特指活動精子以不同方式，如頭對頭、頭對尾、尾對尾或混合型，彼此粘在一起的現象。不活動精子之間、活動精子與黏液絲之間、非精子細胞成分或細胞碎片等粘在一起，為非特異性聚集而非凝集。凝集提示可能存在抗精子抗體，但不足以說明不育是免疫因素引起的，需進一步實驗證明。精子凝集程度:1級:零散的，每個凝集10個精子，有很多自由活動精子。2級:中等的，每個凝集精子數為10-50個，存在自由活動精子。3級:大量的，每個凝集50個精子，仍有一些自由活動精子。4級:全部的，所有的精子凝集，數個凝集又粘連在一起。七、精子活力與活動率精子的活力即精子的運動能力。前向運動精子活力的程度與妊娠率相關。在精液液化后混勻，取一滴精液置于玻片或專門用于精液分析的計數板上，蓋好蓋玻片，系統地觀察至少5個視野，對200個精子進行分級。按WH0（2001）標準分為"a、b、c、d"4級:a級，快速前向運動（即37℃時速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大約相當于5個頭的長度或半個尾的長度）;b級，慢速或呆滯的前向運動;c級，非前向運動（5um/s);d級，不運動。精子活動率為a+b+c級精子百分率總和。鑒于技術人員很難無偏差地精確界定前向運動精子活力，使用手工分析時，WH0-5推薦使用簡單的分類系統，每個精子活力按以下分級:前向運動（PR）:精子主動地呈直線或沿一大圓周運動，不管其速度如何。非前向運動（NP）:所有其他非前向運動的形式，如以小圓周泳動，尾部動力幾乎不能驅使頭部移動，或者只觀察到尾部擺動。不動（IM）:沒有運動。八、精子濃度和總數每次射精的精子總數和精子濃度與妊娠時間和妊娠率有關，并可預測受孕。精子濃度指每單位體積精液中的精子數目，精液中精子濃度與受精和妊娠率有關。國內精子手工分析常用的精子計數板有Makler、Cel-VU和MicroCel等。有研究表明，Cel-VU計數板的計數結果最低，最接近標準乳膠珠溶液濃度的參考值，而血球計數板和Makler計數板的計數結果高估。精子總數:精子濃度乘以整份精液體積可以得出精子總數。精子總數可以評價睪丸產生精子的能力和男性輸精管道的通暢性。以改良牛鮑氏血細胞計數板為例加以說明:使用改良牛鮑氏血細胞計數板網格計數時，僅計數完整的精子（帶有頭部和尾部)。是否計數取決于精子頭部的位置，可忽略精子尾部的位置。方格的邊界由3條線的中間線表示。如精子頭大部分位于兩條內側線中間，計數這條精子，如精子頭大部分位于兩條外側線中間，則不計數這條精子。為避免在相鄰的方格里計數同一個精子，精子的頭部位于分隔兩個相鄰方格的線上，僅當此線是兩條互成直角的分界線的其中一條時，才應被計數。如有很多無頭精子的尾部（大頭針狀頭)、或無尾的精子頭，應在報告中記錄這種情況。必要時，應以與評估精子濃度相同的方式檢測它們的濃度，或者通過染色制片來確定它們與精子的相關程度。評估血細胞計數板的兩個計數池內的精子數目。如果兩個計數池得出的數值十分一致，可以認為取出的樣本可以代表精液標本。精子總數兩次重復計數可能存在的差異見表16-2。精液稀釋固定液:將50gNaHC03和10ml35%（V/V）甲醛溶液加人1000ml蒸餾水中。可同時添加0.25g臺盼藍或5ml飽和（4mg/ml)龍膽紫以加深背景顯示出精子頭部。固定液4℃保存。表16-2對應于特定總數的兩次計數之間的可接受差異（引自WH0-5)總數差異*總數差異*總數差異*35-4548-5463-7041-4755-6271-79總數差異*總數差異*總數差異*80-89197-211367-38590-98212-226386-40699-109227-242407-426110-120243-258427-448121-131259-274449-470132-143275-292471-492144-156293-309493-515157-169310-328516-538170-182329-346539-562183-196347-366563-587*:基于95%可信區間的整數近似值第三節精子存活率檢測精子存活率通過檢測精子膜完整性來評價，當精子活動率低于參考值時應進行精子存活率檢測。通常使用染料拒染法或低滲膨脹試驗來檢測精子膜的完整性，從而推測精子的存活率。染料拒染法基于損傷的細胞膜、死細胞膜允許非透過膜性染料進入膜內染色。低滲膨脹試驗假設只有細胞膜完整的細胞（活細胞）能夠在低滲溶液中發生膨脹。一、伊紅-苯胺黑染色法伊紅-苯胺黑染色可提高背景與精子頭間的對比度，使精子頭更易鑒別。1.伊紅-苯胺黑試劑配制（1）伊紅Y:將0.67g伊紅Y和0.9gNaCl溶解在100ml蒸餾水中，稍加熱。（2）伊紅-苯胺黑:將10g苯胺黑加人100ml伊紅Y溶液中。將懸液煮沸，冷卻至室溫。用濾紙過濾溶液，除去殘渣和凝膠狀沉淀物，儲存在深色密封瓶中。2.實驗步驟取50ul精液與等體積的伊紅-苯胺黑液混合，等待30s,制成涂片，空氣干燥，干燥后立即檢查，或非水性永久封固液封片以后再觀察。用亮視野顯微鏡在x1000倍油鏡下檢查。每個重復樣本評估200個精子。結果評定:用亮視野顯微鏡觀察，活精子頭部呈白色，死精子頭部呈紅色或暗粉紅色。頭部呈淡粉紅色的精子認為是活精子。如果染色只限于頸部區域，頭部的其余區域未染色，這種情況考慮是"頸部膜滲漏"，而不是精子死亡和整個細胞膜破裂的征象信號。這些精子應被評估為活精子。二、伊紅Y染色法1.0.5%伊紅Y試劑配制將5g伊紅Y溶于1000ml0.9%NaCl中。2.實驗步驟（1）將50ul混勻精液和50ul伊紅溶液混合，取10ul上述混合液置于載玻片上。（2）覆蓋22mmx22mm蓋玻片，靜止30s）負相差顯微鏡在200倍或400倍下觀察)（3）計數染色精子（死精子）和非染色精子（活精子）的數目)（4）每份重復樣本評估200個精子，以達到可接受的低取樣誤差）計算重復玻片的兩個活精子百分率的平均值和差異，確定差異的可接受性）如果差異太大，重新兩次精液取樣制備兩張新鮮玻片，再次評估)三、低滲膨脹試驗作為染料拒染法的替代試驗，低滲膨脹試驗（H0s）可以用來評估精子的存活率）當必須避免精子染色的時候，這種方法是有用的，如卵細胞質內單精子注射（ICsI)選擇精子時）膜完整的精子在低滲溶液中5min內發生膨脹，在30min內所有尾部的形狀是穩定的）作為常規診斷，孵育30min,當精子處理用于治療用途時，孵育5min)1.試劑配制（1）用于診斷目的的膨脹液.0.735g枸橡酸鈉和1.351gD-果糖溶于100ml蒸餾水中）將溶液以1ml分裝，凍存于-20℃)（2）用于治療用途的膨脹液.按1份溶液加1份滅菌蒸餾水，即1:2的比例稀釋溶液）2.實驗步驟 （1）解凍凍存的膨脹液，使用前充分混勻) （2）取1ml膨脹液或1ml1+1（1:2）稀釋溶液，置于一只加蓋的微量離心管中，37℃溫熱5min) （3）取100ul混勻精液，加人膨脹液中）用移液管輕輕地吸進和排出，加以混勻) （4）37℃孵育5min或30min,取10ul加到潔凈載玻片上，覆蓋22mmx22mm蓋玻片) （5）重新混勻精液標本，取重復樣本與膨脹液混合）制備另一張重復玻片) （6）使用相差顯微鏡，在x200倍或x400倍視野下檢測) （7）計數未膨脹（死的）和膨脹（活的） （8）每份重復樣本評估至少200個精子，以達到可接受的低取樣誤差）計算重復玻片的兩個活精子百分率的平均值和差異）如差異太大，重新制備兩張新鮮玻片，再次評估)a.未膨脹。b.尾尖膨脹。c.尾尖彎曲膨脹。d.尾尖膨脹伴彎曲膨脹。e.尾彎曲膨脹。f.尾粗短膨脹。g.尾完全膨脹。蒸餾水作為低滲膨脹液，膨脹以“g”形為主，低滲膨脹液以“b”-“f”形為主第四節精子形態學分析精子形態學分析是評價精子受精能力的重要指標之一，人工授精或卵細胞質內單精子注射的成功率與正常形態精子百分率密切相關。目前WH0-5推薦采用巴氏、shor或Dif-0uik染色法，可以很清楚地區分精子頂體和核。Dif-0uik方法是將一滴精液加在帶有固定劑和染色劑的載玻片上，因為這種涂片技術會導致精子的分布不均勻，可能無法觀察到形態學分類所需細節。shor染色可以得到與巴氏染色相近的正常形態精子百分率。一、涂片的制備一般用新鮮液化精液或生理鹽水洗滌過的精子懸液制備涂片，每份標本作雙份涂片，以防染色或操作出問題。由于涂片之間可能存在形態學上的顯著性差異，最好對兩張涂片都進行形態學評估。離心洗滌等技術操作可能影響精子形態，如果使用這些方法必須記錄下來。載玻片應潔凈，可用70%乙醇洗滌并干燥后使用，也可用不掉屑的紙巾擦凈。涂片的厚薄應根據精子濃度而定。涂片的方法有多種，WH0-5使用的方法有拉薄技術和滴管法。拉薄技術即將一滴精液沿成角度的載玻片后緣展開，載玻片向前拖拉，制成涂片;滴管法即對于已洗滌的精液持移液管水平向前推動，將一滴精子懸液沿載玻片的表面展開。精液的黏稠度越低，拉薄效果越好，拉薄技術常常不適用于高黏稠度的精液。涂片在固定及染色之前，應空氣干燥至少4h，但不超過1周。二、巴氏染色法巴氏染色能使精子頭部頂體區與頂體后區、過量殘留胞質、尾部的中段與主段染上顏色，適用于精子的形態學分析和精液中未成熟生精細胞和非精子細胞的檢查。使用巴氏染色制備的精液涂片可以長期保存。1.原理巴氏染液中的俾士麥棕為鹽基性染料，伊紅、亮綠和橙黃為酸性染料，能與細胞中具有相反電荷的組分相結合，而染成各種不同的顏色，從而能清晰地區別多種細胞成分。2.試劑①EA-50（表16-3)。②橙黃G6（表16-4)。③無醋酸Haris蘇木精（表16-5)。④scot溶液:將NaHC033.5g和Mgs04.7H2020.0g溶于1L蒸餾水中。⑤酸性乙醇溶液:300ml99.5%乙醇中加人2.0ml濃HCl,再加人100ml蒸餾水。⑥二甲苯或Rotisol。⑦50%、70%、80%、90%、95%、99.5%乙醇。表16-3EA﹒50的成分伊紅Y俾士麥棕Y亮綠sF蒸餾水95%乙醇磷鎢酸飽和碳酸鋰溶液10g10g10g300ml2000ml4g0.5ml表16-4橙黃G6的成分橙黃G結晶蒸餾水95%乙醇磷鎢酸10g100ml1000ml0.15g表16-5Haris蘇木精的成分蘇木素95%乙醇AlNH4(s0)4.12H20蒸餾水氧化汞8g80ml160g1600ml6g3.操作①潔凈載玻片用70%酒精洗滌后干燥，滴一小滴精液于載玻片上。②當精液黏稠度低時，用第二張載玻片的邊緣在清潔載玻片表面拖拉一滴精液來制備薄片，注意涂片不宜太厚。此技術常常不適宜于精液黏稠的標本。另一種方法是滴一滴精液于一張載玻片的中央，然后將第二張蓋玻片表面朝下蓋在其上，使精液在兩玻片間擴散，輕拉使兩玻片分開即可同時制得兩張片子。③涂片在空氣中干燥后，用等量95%乙醇和乙醚固定5-15min。④固定好的涂片按表16-6步驟進行染色。⑤待染片干燥后，油鏡觀察200個精子，對精子形態進行評估。表16-6巴氏染色步驟溶液操作80%乙醇(V/V)50%乙醇(V/V)蒸餾水Haris或Mayer蘇木精蒸餾水酸性乙醇冷流水沖洗50%乙醇(V/V)80%乙醇(V/V)95%乙醇(V/V)橙黃G695%乙醇(V/V)(3個缸)EA-5095%乙醇(V/V)(2個缸)100%乙醇(2個缸)30s30s30s精確4min30s浸4-8次,每次約1s5min30s30s至少15min1min每缸各浸30s1min每缸各浸30s每缸各浸15s三、精子形態學判斷標準精子包括頭、頸、中段、主段和末段。通過光學顯微鏡很難觀察精子末段，形態分析主要觀察精子頭 （和頸）和尾（中段和主段)，只有頭和尾都正常的精子才認為是正常的。所有處于臨界形態的精子均歸為異常。1.精子頭部正常精子頭外形光滑、輪廓規則，大體呈橢圓形。頂體區清晰分辨，占頭部的40%-70%。頂體區沒有大空泡，小空泡不超過2個，空泡大小不超過頭部的20%。頂體后區不含任何空泡。頭部缺陷主要包括:大頭、小頭、錐形頭、梨形頭、圓頭、無定形頭、有空泡的頭（超過2個空泡，或者未染色的空泡區域占頭部的20%以上)、頂體后區有空泡、頂體過小或過大的頭（小于頭部的40%，大于頭部70%)、雙頭，或上述缺陷的任何組合。2.精子頸部和中段中段應該規則、細長，約與頭部等長。中段主軸與頭部長軸成一條直線。殘留胞質只有在過量時才被認為是異常的，即胞質超過了精子頭大小的1/3時被認為過量殘留胞質。胞質小滴應小于正常頭部1/3。頸部和中段的缺陷主要包括:頸部"彎曲"（頸和尾形成的角度大于頭部長軸的90%)、中段非對稱地接在頭部、粗的或不規則的中段、銳角彎曲、異常細的中段（即無線粒體鞘)和上述缺陷的任何組合。3.精子主段主段比中段細，均一，其長約45um（約為頭部長度的10倍)。尾部應沒有顯示鞭毛折斷的銳利折角。主段可以自身卷曲成環狀。主段缺陷主要包括:短尾、多尾、發卡形平滑彎曲、銳角彎曲、尾部斷裂、尾部彎曲（90o)、尾部寬度不規則、卷曲，或上述缺陷的任何組合。4.過量殘留胞質過量殘留胞質是由于精子異常發生過程產生的。這類異常精子的特征是含有大量不規則已染色的細胞質，胞質的大小超過精子頭部的1/3，常伴有中段缺陷。四、精子形態質量控制只有帶有尾部的可辨認精子，才可進行精子形態分析的計數，精子頭脫落或無精子頭的不作計數，無尾精子亦不作為頭部缺陷計數。選擇精子分布不重疊的區域，在1000倍油鏡下觀察涂片，有順序地對每個視野中所有可評估的精子進行分析，不可有選擇地進行（圖16-3)。盡管是在另一張同一標本涂片上，但也可選擇同一張涂片，重復評估至少200個精子，以達到可接受的低抽樣誤差。根據表16-2或圖16-1來確定差異的可接受性。如果差異值太大，則重復評估相同的涂片。圖16-3人類精子形態異常的示意圖第五節精液白細胞檢測精液的白細胞主要是多形核白細胞（PMN,中性粒細胞)。有時可通過巴氏染色方法，將白細胞與精液涂片的精子細胞和精母細胞區分開來。分辨白細胞主要基于著色、核的大小及形態的不同。多形核白細胞在形態學上容易與多核精子細胞混淆，但是多核型白細胞染色呈淺藍色，而精子細胞呈淺紅色。核的大小也有助于鑒別:單核白細胞核大小的波動范圍較大，從大約7um的淋巴細胞，到15um的巨噬細胞。這些大小僅作為參考，因為退化和分裂會影響核的大小。過氧化物酶陽性的粒細胞是精液中主要類型的白細胞，因此過氧化物酶活性的常規分析法有助于白細胞初篩。白細胞抗原和精子抗原的免疫細胞化學測定技術可特異鑒別白細胞。一、鄰甲苯胺藍過氧化物酶染色法（一）試劑1.67mmol/L,pH6.0的磷酸鹽緩沖液將9.47g磷酸氫二鈉（Na2HP04）溶于1000ml蒸餾水中，將9.08g磷酸二氫鉀（KH2P04）溶于另一1000ml蒸餾水中。然后將一種溶液加人到另一種溶液中直至pH為6.0（約12ml的Na2HP04溶液加人到88ml的KH2P04溶液中)。2.飽和氯化銨（NH4Cl)容液將250gNH4Cl加人到1000ml的蒸餾水中。3.148mmol/L的乙二胺四乙酸二納（Na2EDTA）容液將50gNa2EDTA溶人步驟1準備好的磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中。4.底物將2.5mg鄰甲苯胺溶于10ml的0.9%（9g/L）氯化鈉溶液中。5.30%（V/V）過氧化氫（H202）容液。6.工作液往9ml鄰甲苯胺底物中加人1ml飽和NH4Cl溶液、1ml148mmol/lNa2EDTA溶液及10ul30%（V/V）H202溶液，充分混勻。該溶液配制后可使用24h。（二）步驟1.取0.1ml混勻精液并與0.9ml工作液混合。2.渦旋振蕩精子懸液10s,室溫放置20-30min。或使用試管搖動裝置持續搖動。3.重復樣本與工作液混勻。取樣前，再次混勻精液標本。4.在血細胞計數板上檢測過氧化物酶陽性細胞的數目。5.20-30min后，再次混勻精子懸液，并將雙份重復樣本分別充填計數板兩側的計數池。6.室溫下將血細胞計數板水平置于濕盒內至少4min,防止干燥，使細胞沉降。7.用200或400倍鏡的相差顯微鏡檢查計數池。8.每份重復樣本至少計數200個過氧化物酶陽性細胞，以達到可以接受的低取樣誤差。過氧化物酶陽性細胞被染成棕褐色，而過氧化物酶陰性細胞不著色。二、全白細胞CD45免疫細胞化學染色釋放顆粒的多形核白細胞，以及不含過氧化物酶的其他種類白細胞如淋巴細胞、巨噬細胞或單核細胞，不能應用檢測細胞過氧化物酶的鄰甲苯胺實驗來評估，但是可以使用免疫細胞化學方法來檢測。人白細胞的所有類型表達一種特異性抗原CD45，故可用抗CD45單克隆抗體來檢測不同類型的白細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞、B細胞或T細胞等。第六節計算機輔助精子分析計算機輔助精子分析（computer-aidedspermanalysis,CAsA）客觀、高效、精度高，容易進行室內質控及室間質控。CAsA除可分析精子濃度和活動率等精子參數指標外，更能客觀地定量評價精子運動速度和運動方式，大大克服了傳統測定方法所存在的費時、信息量少、準確度差、主觀性高等缺陷。與國外普遍使用人工分析不同，CAsA的使用情況在中國相對較普遍。如果標本準備和儀器使用時足夠細心，CAsA在目前可用于一些臨床常規診斷檢測，但要建立并維持高標準的儀器操作，質量控制必不可少。CAsA分析儀能夠識別活動精子，適宜應用于精子動力學分析。很多因素會影響CAsA分析儀的性能，如標本的制備、幀頻率、精子濃度和計數池的深度等，因此要做好多方面的質量控制。使用前，應先對CAsA分析儀進行正確設置和調試，以保證設備良好的工作狀態。制造商提供了適宜的參數，但使用者必須檢查分析儀運行是否達到了其所要求的重復性和可靠性程度，必須使用適當的質量控制措施，如錄像帶等。因為精子的運動對溫度敏感，必須將CAsA系統精液標本溫度保持在37℃。在精液液化后混勻，取一滴精液置于玻片或專門用于精液分析的計數板（Makler或Macro精子計數板）上，蓋好蓋玻片，光學顯微鏡（x400)GH,系統地觀察至少12個視野，每份標本至少要分析200個活動精子的運動軌跡，最好是400個。對每個標本中分析的精子數目應標準化。按WH0（2001）標準分為"a、b、c、d"4級:a級，快速前向運動（即37℃時速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大約相當于5個頭的長度或半個尾的長度）;b級，慢速或呆滯的前向運動;c級，非前向運動（5um/s);d級，不運動。適宜檢測精子活力的樣本精子濃度為2x106-50x106/ml。當精子濃度50x106/ml時，可能會出現高頻度精子碰撞，由此可能產生誤差，此時應進行稀釋，并且最好使用該標本的精漿稀釋。精液樣本稀釋方法:取一定量精液樣本16000g離心6min,分離上層獲得無精子的精漿。用無精子的精漿稀釋最初的精液標本，使精子濃度低于50x106/ml。CAsA分析可獲得如下精子運動參數:①軌跡速度（curyilinearyelocity,VCL）（um/s):也稱曲線速度，為精子頭部沿其實際行走曲線的運動速度，即在顯微鏡下見到二維方式運動軌跡的時均速率，反映精子活動能力。②平均路徑速度（ayeragepathyelocity,VAP）（um/s):精子頭沿其空間平均軌跡的運動速度，這種平均軌跡是計算機將精子運動的實際軌跡平均后計算出來的，算法因儀器不同而有差異，故不同CAsA系統所得的數值可能不具可比性。③直線運動速度（straightlineyelocity,VsL）（um/s):也稱前向運動速度，即精子頭部直線移動的速度。④直線性（linearity,LIN)（%）:也稱線性度，為精子運動曲線的直線分離度，即VsL/VCL。⑤精子側擺幅度（amplitudeoflateralheaddisplacement,ALH）（um）:精子頭實際運動軌跡對平均路徑的側擺幅度，可以是平均值，也可以是最大值。⑥前向性（straightness,sTR)（%）:計算公式為VsL/VAP,也即精子運動平均路徑的直線分離度。⑦擺動性（wob-bly,W0B)（%）:精子頭沿其實際運動軌跡的空間平均路徑擺動的尺度，計算公式為VAP/VCL。⑧鞭打頻率（beatcrosfrequency,BCF)（Hz):也稱擺動頻率，即精子頭部跨越其平均路徑的頻率。⑨平均移動角度（ayeragemotiondegree,MAD)（度/秒）:精子頭部沿其運動軌跡瞬間轉折角度的時間平均值。⑩精子運動濃度:每毫升精液中VAP0um/s的精子數。第七節附屬性腺生化指標的檢測檢測精漿中附屬性腺標志性分泌物的含量，可以反映腺體功能，例如，游離左旋肉堿、甘油磷酸膽堿（GPC)、中性a-葡糖苷酶反映附睪功能;果糖和前列腺素反映精囊腺功能;檸檬酸、鋅、y-谷氨酰轉移酶和酸性磷酸酶反映前列腺功能等。精漿生化測定的標本可-20℃保存待測，忌反復凍融。一、精漿中性α-葡糖苷酶測定精漿中存在兩種a葡糖苷酶的異構體，其中中性a-葡糖苷酶僅來源于附睪;酸性a-葡糖苷酶主要來源于前列腺，后者可以被十二烷基硫酸鈉（sDs）選擇性抑制，從而可以測定反映附睪功能的中性a-葡糖苷酶。用澳洲栗精胺（castanospermine）抑制藥阻斷非葡糖苷酶的相關底物，可使測試更敏感。精漿酸性a-葡糖苷酶被抑制，中性a-葡糖苷酶將合成的毗喃葡糖苷底物轉化為對硝基苯酚，加人碳酸鈉后變為黃色，其顏色深淺與單位時間內精漿中性a-葡糖苷酶活性成正比。檢測精液中附睪中性a-葡糖苷酶含量有商品化試劑盒。建議使用含sDs和澳洲栗精胺的試劑盒測定精液中附睪中性a-葡糖苷酶。（一）試劑1.緩沖液緩沖液1（0.2mol/L磷酸緩沖液，pH6.8）:溶解4.56gK2HP04于100ml蒸餾水，另溶解2.72gKH2P04于100ml蒸餾水，將兩者等混合至pH為6.8。緩沖液2:溶解1gsDs于100ml緩沖液1。2.顯色劑顯色劑1（用于終止反應，0.1mol/LNa2C03）:溶解6.20gNa2C03.H20于500ml蒸餾水。顯色劑2:溶解0.1gsDs于100ml顯色劑1。3.底物p-硝基苯酚叱響葡糖苷（PNPG)（5mg/ml）溶解0.1gPNPG于20ml緩沖液2，50℃加熱板上攪拌，并振蕩約10min。使用過程需將溶液保持在37℃。每次測試需配制新鮮試劑。4.用于精液空白的葡糖苷酶抑制藥（castanospermine,10mmol/L）溶解18.9mg澳洲栗精胺于10ml蒸餾水。用蒸餾水稀釋10倍為1mmol/L的工作液。約1ml分裝，-20℃凍存。5.產物p-硝基苯酚（PNP）的標準曲線（5mmol/L）溶解69.5mgPNP于100ml蒸餾水，必要時加溫溶液。用鋁箔包裹或裝在棕色玻璃瓶里，4℃避光儲存。每3個月配制新鮮的標準液。6.制備標準曲線加400ul5mmol/LPNP儲存液于10ml容量瓶中，加顯色劑2定容至10ml（200umol/L)。將200umol/L標準液加顯色劑2稀釋，得到另外4個標準液:160，120，80和40umol/LPNP。）二）方法1.精液標本以2000g離心10min,精漿可保存于-20℃。2.取15ul精漿標本分別加人2個1.5ml試管中。蒸餾水空白。3.向質控樣本加人8ul1mmol/Lcastanospermine,作為精漿空白值。4.每管加人37℃的100ulPNPG底物液，37℃孵育2h。5.每管加1ml顯色劑1混勻。405nm波長處檢測，水空白調零。6.通過比較吸光度值，從標準曲線（umol/L）上讀取標本產生的PNP濃度。乘以校正因子（0.6194)，得到未稀釋精漿中性葡糖苷酶的活性（U/L)。從每份標本活性減去精漿澳洲栗精胺活性，得到校正的（相關的葡糖苷酶）活性。7.精液的葡糖苷酶活性（mU）=校正的葡糖苷酶活性x精液總體積（ml)。兩份重復測定結果的一致性應在10%之內。如不符，取2份新的精液標本樣品，重新檢測。 （三）精漿果糖測定果糖與叫味在加熱和強酸的影響下形成了有顏色的復合物，對470-490nm波長有最大吸收峰，其吸光度與果糖含量成正比。可使用檢測精漿果糖含量的商品化試劑盒。1.精液標本以2000g離心10min,精漿可保存于-20℃。2.取5ul精漿標本分別加人50ul蒸餾水中，混勻。3.脫蛋白:加人12.5ul63umol/LZns04和12.5ul0.1mol/LBa（0H）2，混勻。室溫15min,8000g離心5min。4.取50ul上清液移人檢測管。50ul每種標準液。蒸餾水空白。5.檢測管加人50ul叫味液，混勻。6.檢測管加人0.5ml濃鹽酸（HCl,32%V/V)，用實驗室模壓封膜封管口，在通風櫥內小心地混勻。7.50℃熱水浴20min。混勻，冰水冷卻15min。470nm波長處檢測，蒸餾水空白調零。8.結果乘以稀釋因子16精漿果糖濃度。精液中果糖的總量=果糖的濃度x精液總體積。重復樣本測定結果的一致性應在10%之內。否則，新取2份重復精液標本，重新檢測。 （四）精漿鋅的測定精液中鋅主要來自前列腺，其含量比血清中高100倍以上，精漿鋅是前列腺的功能指標之一。精漿鋅可用化學比色法測定。利用化合物2-（5-溴-2-毗啶）-5-（N-丙基-N-硫代丙氨基）-酚（5-溴-PAPs）[2-（5-bromo-2-pyridylazo)-5-（N-propyl-N-sulfopropylamino)-phe-nol（5-Br-PAPs)]與鋅結合，生成特異性的鋅-色原復合物，對560nm波長有最大吸收峰，其強度與精漿鋅含量成正比。檢測血清鋅含量有商品化試劑盒。僅使用顯色劑A和顯色劑B。1.精液標本2000g離心10min,取精漿于-20℃待分析。2.取5ul精漿加人300ul蒸餾水，混勻。3.取40ul稀釋精漿樣本于96孔板中，每孔加200ul顯色液，混勻5min。4.在560nm波長處讀取結果，用水空白調零。5.通過比較吸光度值，從標準曲線上讀取標本中鋅的濃度。6.結果乘以稀釋因子61得到精漿鋅濃度。7.精液中鋅的總量=鋅的濃度x精液總體積。重復樣本測定結果的一致性應在10%之內。即（兩個估計值之差除以估值的平均值）x100≤10%。如果不符合，再次取2份重復精液樣本，重新檢測。第八節精子頂體完整率分析精子頂體含有頂體蛋白酶、透明質酸酶、酸性磷酸酶等多種水解酶。在受精時，精子釋放頂體酶，分解卵子外周的放射冠與透明帶，進入卵子內。頂體酶還能降低宮頸黏液的黏度，提高精子穿透宮頸黏液的能力。精子頂體分為4型。I型:精子形態正常，著色均勻，頂體完整，頂體邊緣整齊，有時可見清晰的赤道板。Ⅱ型:頂體輕微膨脹，精子質膜疏松膨大。Ⅲ型:頂體破壞，精子質膜嚴重膨脹破壞，著色淺，邊緣不整齊。N型:頂體全部脫落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、N型均為頂體不完整精子，計算頂體完整率時計數200個精子，計算I型頂體精子的百分比。頂體完整率（%）=頂體完整精子數/精子總數x100%精子結合卵透明帶后，在卵透明帶上發生生理性頂體反應。誘發頂體反應后的頂體狀態檢測可用熒光標記的凝集素（如豌豆凝集素、花生凝集素）或頂體抗原CD46的單克隆抗體，通過顯微鏡或流式細胞儀分析結果。頂體狀態熒光檢測方法如下。一、試劑1.PsA-FITC豌豆凝集素（PsA)，用異硫氰酸熒光素（FITC）標記。2.磷酸鹽緩沖液（PBs)，pH為7.4。3.0.9%（9g/L）的氯化鈉溶液。4.95%（V/V）的乙醇溶液。5.PsA儲存液將2mg用FITC標記的PsA溶解于4mlPBs中，-20℃保存。PsA工作液:將0.5mlPsA儲存液稀釋于10mlPBs中，儲存于4℃備用（可存放4周)。二、精子洗滌1.將0.2ml混勻精液加人10ml生理鹽水中。2.800g離心10min。棄去上清液，留下20-40ul上清液。輕柔吹打，將精子沉淀團重懸于留下的上清液中。3.重復以上精子洗滌操作步驟。4.用生理鹽水將上游后或經過一次密度梯度離心的精子懸液稀釋至10ml。5.重復步驟2。6.取5ul精子懸液，制成約1cm長的精子涂片，共做2張重復涂片。7.在400倍相差顯微鏡下觀察濕涂片。確保精子均勻分布在玻片上，不聚集。8.空氣中干燥玻片。9.95%（V/V）乙醇固定30min。10.空氣中干燥玻片。11.加10mlPsA-FITC工作液到垂直染色缸中。12.將已固定并空氣干燥的涂片浸在PsA-FITC熒光染料中。13.在4℃條件下，染色1h以上。14.用純凈水洗滌每張玻片，并且用可溶于乙醇的封片劑封片。15.結果評估:用450-490nm激發光，于400倍油鏡下觀察精子涂片。精子分類如下。頂體完整（acrosome-intact,AI):精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻。已發生頂體反應（acro-some-reacted,AR）:精子僅在赤道帶出現熒光帶，或者頂體區根本沒有熒光染色。頂體異常:除上述兩類精子外的所有其他精子。每張涂片計數200個精子，以達到可接受的低取樣誤差。計算2張重復涂片已發生頂體反應精子百分率的平均值和差異。如果差異太大，則重新評估。.第九節抗精子抗體的檢測精液中的抗精子抗體大多為IgA和IgG,IgM抗體相對分子質量較大在精液中極少發現。IgA抗體可能比IgG抗體具有更重要的臨床意義。精子表面抗體檢測可采用直接免疫珠（IB）試驗和混合抗體蛋白反應（MAR）試驗。檢測精漿、血清、宮頸黏液中抗精子抗體的間接試驗可采用間接免疫珠（IB）試驗和酶聯免疫吸附法（ELIsA）試驗。直接免疫珠和混合抗體蛋白反應試驗采用新鮮精液標本，而間接免疫珠試驗采用洗滌過的精子。這兩種試驗的結果并不總是一致，但間接免疫珠試驗的結果與檢測血清抗體的制動試驗的結果相關性很好。一、