輔助生殖科人工授精診療規范與技術操作規范一、概述人工授精（artificialinseminati。n，AI)是指采用非性交的方式將精子遞送到女性生殖道來達到生育目標的系列技術。按照其精子的來源，AI可分為來自丈夫精子的夫精人工授精（artificialinseminati。nwithhusbandsemen，AIH）和來自第三方精子的供精人工授精（artificialinseminati。nwithd。n。rsemen,AID)。1790年，英國人J。hnHunter首次用注射器將尿道下裂患者精液注射到其妻子陰道內獲得正常妊娠:1884年，費城WilianPankhurst首次采用供者精液進行AI治療獲得成功。AI也可按照不同授精部位分類，如陰道、宮頸管、宮腔、輸卵管和腹腔的授精被分別稱為陰道內人工授精（intrayaginalinseminati。n,IVI)、宮頸管內人工授精（intraceryicalinseminati。n，ICI)、宮腔內人工授精（intrauterineinseminati。n,IUI)、輸卵管內人工授精（intrafal。pianinseminati。n,IFI)和腹腔內人工授精（intraperit。nealinseminati。n,IPI)。1866年，紐約城婦產醫院的Mari。nsims采用ICI/IUI技術治療性交后試驗陰性的不孕婦女獲得了一例成功。ICI和IUI仍然是目前最常用的AI治療技術，ICI多用于男性精液參數正常，但生殖器發育異常（如尿道下裂)、性功能或射精功能障礙的不孕夫婦，以及需要接受AID治療的患者:IUI則主要用于男性少弱精子癥、女性宮頸異常相關的輔助生殖治療。體外受精（inyitr。fertilizati。n，IVF）技術的出現帶動了精子制備技術的發展。精子的洗滌、上游、下游，以及密度梯度分離等系列技術的臨床應用再次喚起了人們對AI技術治療的關注。相對于IVF技術，AI技術較為簡單、價廉，相對較少地干預正常的生殖過程，因而有更廣的適應證范圍，被認為是輔助生殖技術（asistedrepr。ductiyetechn。l。gies,ART)中一線治療技術。二、機構開展AI治療的設置標準在我國，AI和其他ART技術一樣，屬于限制性使用技術，設置AI技術治療機構需要符合區域衛生行政規劃和行業法規的基本標準。為此，衛生部頒布了《人類輔助生殖技術管理辦法》（2001年衛生部14號部長令)、《衛生部關于修訂人類輔助生殖技術與人類精子庫相關規范、基本標準和倫理原則的通知》（衛科教發[2003]176號）和《衛生部人類輔助生殖技術與人類精子庫校驗實施細則》（衛科教發[2006]44號）等系列法規，其中，對開展AI的機構設置、人員要求、工作場所、設備條件、質量控制標準進行了最低標準規定，提出了制度和倫理規范化管理的系列要求，以及動態化的管理模式 （見衛生部相關文件)。三、夫精人工授精技術診療常規（一）夫精人工授精技術臨床診療常規1.適應證（1）男方因素:精液液化異常，逆行射精，性功能障礙，生殖器畸形等。如精液常規分析參數正?？煽紤]ICI治療;男性少、弱精子癥等可進行精子制備后行IUI治療，但制備后前向運動的精子數不宜少于500萬條（過少的前向運動精子數會使臨床妊娠率下降)。（2）女方因素:女方至少有一側輸卵管完全暢通，且輸卵管碘油造影證實無影響輸卵管拾卵功能的盆腔粘連，但有宮頸因素不育;或生殖道畸形及心理因素導致性交障礙等;或排卵障礙促排卵治療無效后;或子宮內膜異位癥等。（3）免疫性因素:精液抗精子抗體檢測時，至少在一份精液樣本中，發現有50%或以上的活動精子包被，且經過精子-宮頸黏液接觸實驗、體內性交后實驗、體外精子-宮頸黏液接觸實驗等評估抗體生物學重要性后加以證實。（4）原因不明不孕。（5）符合計劃生育政策。2.禁忌證（1）男女一方患有生殖泌尿系統急性感染或性傳播疾病。（2）一方患有嚴重的遺傳、軀體疾病或精神心理疾患。（3）一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期。（4）一方有吸毒等嚴重不良嗜好。3.門診檢查常規宜于AIH治療前1個月左右就診完成術前檢查，要求患者準備身份證、結婚證、生育證。門診檢查包括以下內容。（1）男女雙方病史采集。包括不孕不育年限（未采用避孕的時間）;婚姻狀況、曾用過的避孕方法;初潮年齡、月經周期、經期、末次月經、是否伴發痛經及其發生的時間和嚴重程度;孕產史、伴發的并發癥;近期心理、情緒、進食、過度運動史;盆腹腔痛、低熱、畏寒、白帶異常史;泌乳、多毛、痤瘡、體重改變史;既往結核等特殊傳染病史、盆腔炎、既往性傳播疾病史，以及治療情況;盆腔或腹腔手術史、自身免疫性疾病史、既往重病和外傷史以及幼時的特殊患病史;藥物過敏史;吸煙、酗酒、成癮性藥物、吸毒史;職業以及特殊環境、毒物接觸史;家族中有無出生缺陷、智障、不孕不育史。近期不育相關檢查及治療經過。男性還包括青春期開始時間、性交頻率和時間、有無勃起和（或）射精障礙;有無與其他配偶懷孕;有無性傳播疾病、泌尿生殖系感染、腮腺炎合并睪丸炎或其他病毒性睪丸炎;有無腎臟疾病、糖尿病、附睪炎、纖維病變、結核，及其他全身性疾病;有無睪丸手術、腹股溝疝修補術、輸精管結扎、陰囊損傷、睪丸扭轉，以及其他盆腔和腹腔手術史;是否有高溫、放射和有毒環境暴露史，煙酒、咖啡因攝人史;有無服用磺胺類抗生素、合成代謝的類固醇激素等生殖毒性藥物;有無隱睪、男性乳腺增生、性腺低下、嗅覺喪失、中線缺陷（腭裂)、男性纖維病變等先天性發育異常。（2）體格檢查。女性的體格檢查至少包括:體格發育及營養狀況、身高、體重、體脂分布特征、乳房及甲狀腺情況等;是否呈現雄激素過多體征:多毛、痤瘡、黑棘皮征等;外陰發育、陰毛分布、陰道和宮頸異常排液和分泌物;子宮大小、形狀、位置和活動度;附件包塊和壓痛;子宮直腸凹處的包塊、觸痛和結節;盆腔和腹壁壓痛、反跳痛;盆腔包塊。男性的體格檢查至少包括:身高、體重、血壓及是否肥胖;男性第二性征發育、男性乳房發育;陰莖（有無尿道下裂、瘢痕、硬斑、潰瘍或尿道分泌物)、睪丸（有無下降不全、異位或回縮;睪丸體積是否12ml;睪丸質地、有無陰囊腫塊)、附睪（能否觸及，位置，有無囊腫、結節及壓痛)、輸精管（能否觸及，有無增厚，結節及觸痛)、腹股溝區檢查（有無疝、瘢痕或淋巴結腫大、有無精索靜脈曲張)、前列腺（有無疼痛，或質地堅硬)、精囊（可否觸及、有無壓痛）等生殖系統檢查。（3）輔助檢查和實驗室檢查。女方檢查包括:基礎體溫測定;子宮輸卵管碘油造影術或腹腔鏡等手術確認輸卵管是否通暢、排除盆腔粘連;排除不能耐受妊娠的疾病等;基礎內分泌檢查:雌二醇（E2)、促卵泡生成素（FsH)、促黃體生成素（LH)、睪酮（T)、催乳素（PRL）;抗子宮內膜抗體、抗心磷脂抗體檢測;風疹病毒、弓形蟲、皰疹病毒、巨細胞病毒篩查;白帶常規、宮頸分泌物支原體、衣原體、線索細胞、宮頸涂片檢查;空腹血糖。推薦進行胸部x線片、心電圖檢查。男女雙方的檢查包括:血/尿常規、肝腎功能、紅細胞沉降率、血型（AB0Rh）;乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒、淋球菌;抗精子抗體。如有下列情況推薦進行染色體檢測:①有習慣性流產、死胎、死產史;②出生過畸形、智力低下或者染色體病患兒;③原發不孕。男方檢查包括:精液分析;男方為少精子癥時，進行染色體檢測和Y染色體微缺失檢測。4.臨床操作常規（1）啟動治療前，機構應根據我國現行計劃生育政策的要求查驗和復印身份證、結婚證和準生證;給病人進行相關信息和注意事項的宣教、溝通，必要時予個體化的心理輔導，最后簽訂簽署知情同意書。（2）建立檔案:臨床醫生負責書寫專科病歷，并核對術前準備的各項檢測是否正常（臨床檢測1年內有效)。（3）制訂治療方案:臨床組醫生應根據患者個體情況，討論和制定用藥方案及授精方式。（4）排卵監測與授精時機。①對有規律月經周期且有自行排卵的女性，可在自然的月經周期中根據月經周期的天數、宮頸黏液評分、基礎體溫的測定、結合血或尿LH水平及陰道B超監測卵泡發育來判定。通?？稍谥芷诘牡?-11天開始行B超卵泡發育監測，當優勢卵泡直徑達16mm時，可開始宮頸黏液評分和半定量尿LH的監測。當達到18mm或以上時，可酌情抽血監測E2、LH水平直到排卵日。月經周期:育齡女性的正常月經周期為21-35d，平均月經周期為28d。當月經周期為28d時，排卵發生于第13-15天。有些女性在月經周期中期可出現與排卵有關腹痛?；A體溫確定:在月經周期的卵泡期，基礎體溫相對較低，在排卵期由于產生黃體酮（孕酮)，體溫至少升高0.5℃，這一體溫持續幾天。在體溫雙相的轉換日或其后1天被認為是排卵日。宮頸黏液評分:常用Bilings評分法，根據黏液量、拉絲度、結晶及宮口關閉和開張情況客觀地評價宮頸黏液。黏液產生開始時是濃稠的、渾濁的，接近排卵時，黏液變得豐富，光滑透明，有彈性，這種狀況利于精子通過，改變2-3d;排卵后，黏液再次變得黏稠。人工授精應在宮頸黏液最大評分日施行。LH水平的測定:尿LH峰后12-24h排卵。臨床常應用尿試紙測定尿LH峰來預測排卵，試驗從第11天開始，直到排卵。此方法簡單、價格低廉、可自行監測。自然周期血LH峰出現后24-36h排卵。超聲監測:可動態直觀的監測卵泡地生長發育和排卵情況。卵發育時，卵泡增大，排卵前，卵泡壁薄，充滿液體，排卵通常發生在卵泡直徑達18-25mm時。已排卵的超聲波表現為成熟卵泡驟然消失或成熟卵泡明顯縮小，且卵泡內透聲減弱，直腸子宮陷凹出現液體積聚。宜在排卵前24h內行人工授精。次日行B超檢查排卵情況，若仍未排卵可以考慮再次行AI治療。當主導卵泡直徑達18mm以上且出現尿LH峰時，則于LH峰后12-24h左右授精一次;當主卵泡直徑達18-20mm仍無LH峰出現時，注射HCG5000-10000U,授精時間一般為HCG后36-40h。②對于有排卵障礙（如多囊卵巢綜合征、下丘腦性閉經等)、原因不明不孕、自然周期卵泡發育不良、自然周期失敗或年齡較大（35周歲及以上）等病因的患者，可采用藥物誘導排卵。有多種誘導排卵的方案適應于不同情形下的AI治療。通常，在誘導排卵周期用藥日，應行B超觀察基礎卵泡的數目及大小，用藥過程中應進行B超監測卵泡生長和發育、子宮內膜同步增長情況，指導藥物劑量的調整。若卵泡直徑≥12mm,則隔天進行B超、LH檢查監測卵泡發育，囑男方手淫法排精1次;當卵泡直徑≥14mm時，每日B超監測和LH檢查直至排卵。若卵泡直徑達18-20mm,尿LH陽性者，可注射人絨毛膜促性腺激素（humanch。ri。nicg。nad。tr。pin,HCG)，用于精確地預測排卵時間（HCG注射宜在內源性LH峰開始之前)，于當天下午或次日行AI;若尿LH陰性者，當天晚上10點注射HCG5000-10000U,次日上午行IUI。常用的藥物誘導排卵方案包括:氯米芬（cl。mifenecitrate,C）+HCG方案:適用于體內有一定內源性雌激素水平的無排卵患者。月經第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天給C50-100mg/d，連續5-7d用藥。當主導卵泡18mm,予HCG5000-10000U,肌內注射，促進卵泡成熟。另可加用補佳樂1-2mg/d，改善C的抗雌激素作用。促性腺激素（g。nad。tr。pin,Gn）+HCG方案:適用于使用C誘導卵泡生長失敗者或低促性腺激素性閉經。月經第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天或測定血清激素水平，如果E250pg/ml,子宮內膜厚度5mm,基礎卵泡直徑5mm,可開始給予促性腺激素，37.5-150U/d，肌內注射，至卵泡成熟。C+Gn+HCG方案:適合于單用C卵泡發育欠佳者，可加用促性腺激素。月經第3-5天或黃體酮撤退出血第3-5天給C50-100mg/d;第5-9天給HMG/FsH75-150U/d，之后根據卵泡發育情況調整劑量?？诜铣杀茉兴帲āalc。ntraceptiyes,0C）+促性腺激素釋放激素類似物（GnRHa）+HMG/FsH+HCG:主要適應于基礎LH10U/ml或既往有提前的LH峰現象的患者、PC0s患者。助孕前1-3個月經周期口服合成避孕藥，月經第21-23天注射長效GnRHa1.5-1.8mg,助孕周期MC3-5確定Em厚度6mm且已達降調節后（E250pg/ml,LH10mU/ml,F10mm)，開始予HMG/FsH75U,肌內注射，每日1次，連用5-7d，之后根據卵泡發育情況調整劑量，一般以37.5-75U遞增或遞減方式調量。如3-5d未達到要求，繼續觀察3-5d，必要時改用超長方案或取消周期。在藥物誘導卵泡生長過程，應控制16mm卵泡數不應超過4個，避免多胎和卵巢過度刺激綜合征 （。yarianhyperstimulati。nsyndr。me,0Hss)的發生。以下情形必要時需采取卵泡穿刺輔助卵子釋放:①既往有卵泡黃素化未破裂綜合征史的患者，在注射HCG后40h觀察優勢卵泡仍未破裂者;②16mm卵泡數目多于5個者，為防止多胎妊娠及0Hss，酌情采取卵泡穿刺術將多余卵泡抽出。（5）授精操作常規:盡管可能的授精方法有5種，但目前臨床上常規使用主要是ICI和IUI兩種授精方式。①ICI:主要適用于性交不能、性交后不射精、精液不液化患者。術前排空膀胱，患者取膀胱截石位，臀部略抬高，以陰道窺器暴露子宮頸，用生理鹽水消毒棉球揩凈子宮頸外口周圍黏液，將裝有液化后精液的注射器以低壓緩慢注人子宮頸管內，退出窺器，患者平臥1h。②IUI:是AIH最常用且成功率最高的人工授精方法，主要適用于男方少、弱、畸形精子癥，女方宮頸因素不孕，免疫性不孕，原因不明不孕等患者。授精前如患者子宮為極度前傾前屈，建議術前1h喝水250ml,其他患者術前均建議排空膀胱。體位同ICI,生理鹽水沖洗患者陰道及宮頸管外口，授精管吸出洗滌好的精液，護士和醫生以及患者相互核對后，排除管內空氣后輕柔將授精管插入宮腔內（一般過宮頸內口1-2cm即可)，再將0.3-0.5ml制備后精子懸液緩慢注人宮腔后停留1min左右退管。術后患者抬高臀部臥床休息至少30min。（6）黃體支持:對于誘導排卵周期、年齡35歲、黃體功能不全、原因不明不孕等患者AI術后需行黃體支持。①黃體酮:可肌內注射黃體酮20-40mg/d，從授精日開始，16d后驗血或尿HCG,妊娠后繼續使用至孕8-10周逐漸減量停藥。②HCG:AI術后可用HCG進行黃體支持，2000U/次，從授精日開始每3天肌內注射1次，共3次。某些患者可考慮聯合應用或加用雌激素類藥物，0Hss高?；颊卟挥肏CG行黃體支持。（7）術后注意事項和隨訪:離院前向病人交代禁同房、禁盆浴、禁游泳2周;采用藥物誘導排卵的患者若有惡心、嘔吐、腹痛、嚴重腹脹、體重明顯增加等卵巢過度刺激癥狀，或其他特殊癥狀如陰道流血等應立即復診或當地就診。①確定妊娠:AI術后16-18d如未行經，則開始測尿HCG,若為陽性為妊娠;若弱陽性繼續黃體支持，過3d復查尿妊娠試驗，若為陽性為妊娠;若陰性為生化妊娠;若為弱陽性應繼續隨訪，以排除宮外孕。已診斷妊娠的病例應于術后30d左右行陰道B超檢查確定臨床妊娠情況，包括觀察有無宮內孕囊、有幾個孕囊、孕囊內有無胚芽及心搏、胚芽大小與孕周是否符合、有無宮腔積液，同時應仔細掃描雙附件，看有無宮外孕囊。如三胎以上妊娠，必須行減胎術。②隨訪:已確定妊娠的患者應繼續隨訪，包括早、中、晚孕期情況，分娩情況和新生兒情況，出生后1歲情況，以后不定期隨訪母嬰健康狀況。（8）并發癥及處理:術中的可能并發癥包括持續少量陰道流血;宮腔積血;下腹疼痛。術后應追蹤有無0Hss、卵巢扭轉等并發癥發生;經促排卵后妊娠的病例即使宮內見孕囊也不能排除宮內外混合妊娠，如血HCG濃度上升緩慢更應高度警惕異位妊娠。①出血:少量的出血一般發生在宮頸外口和宮頸管，處理原則為壓迫止血，預防感染。較多量出血發生在卵泡穿刺術后，需要住院處理。②腹痛:術中一般發生在宮頸牽扯和精液注人速度過快時。術后出現應警惕0Hss和卵巢扭轉、破裂、感染、宮外孕、流產等。一般在操作停止后，腹痛會自行緩解;極少數發生劇烈腹痛者，可予阿托品0.5mg肌內注射。其他情況對癥處理。③感染、休克:術時適當使用抗生素，極少發生，按照相關原則處理。④多胎妊娠:預防措施:盡量避免多卵泡發育，如優勢卵泡≥4個，建議取消IUI或行卵泡穿刺術將多余卵泡抽出。處理原則:發生3胎及以上妊娠者，應在妊娠8+周實施減胎術。⑤卵巢過度刺激綜合征（0Hss）:慎重使用促排卵藥物，不予注射或減量注射HCG誘發排卵:不用HCG支持黃體;必要時可取消IUI周期或抽吸多余的卵泡后行IUI。處理原則:輕度嚴密觀察，鼓勵病人多飲水，少吃多餐進食;中到重度應住院治療，每天監測出入量，腹圍;注意HCT,水電解質平衡，肝腎功能，血凝狀態，卵巢大小，腹水情況;鼓勵少量多次進食，鼓勵飲水，補充血容量、白蛋白及電解質;腹水及胸水嚴重者可抽胸腹水:在血容量不足和血液濃縮的情況下，不能使用利尿劑;其他對癥治療。⑥異位妊娠:發生率低，一旦確診必須住院治療。（9）性交后試驗（p。st-c。italtest,PCT）:是一種體內宮頸黏液功能檢查，目的在于了解精子對子宮頸黏液的穿透性能，同時還可以了解宮頸黏液性狀，精液質量及性交是否成功等有關情況。①方法:試驗應選擇在排卵期進行，試驗前至少2d避免性交。在前一天晚上同房。檢查時將未用潤滑劑的陰道窺器置人，用吸管在陰道后穹窿部吸取混合樣本（證實精液確實曾存留于陰道內)。然后再用另一吸管吸取宮頸黏液標本。將這些標本置于載玻片上，加上蓋玻片，使用相差顯微鏡在標準厚度下進行檢查。性交后試驗檢測宮頸黏液的時間一般為9-24h。②結果分析:如果宮頸黏液中存在適量快速直線前向運動的精子，就可排除宮頸因素作為不育原因的可能性;PCT初試結果陰性或不正常，應重復進行性交后試驗。如果操作正常，重復檢測仍為陰性，則提示為宮頸黏液引起的不孕。③注意事項:同房時不能使用潤滑劑，也不能在性交后進行盆浴、陰道沖洗，在性交后可以沖淋浴。（二）實驗室操作常規1.取精時間安排當女方主導卵泡達15mm左右時，應通知男方排精一次，之后一直禁欲到授精日再取精（取精前一般禁欲48h至7d，過長或過短的禁欲時間均有礙精子的質量，但對于精液差的病例可適當延長禁欲時間)。2.精液收集取精時間安排在IUI前1-2h，核對夫婦證件（結婚證、身份證、計劃生育部門開具的生育證明)，確認丈夫身份，簽署《接受助孕夫婦取精認證書》。有條件的中心可留存精液樣本以備查。（1）環境:應有專用的取精室，室內配有單人床和洗手裝置，環境溫馨、溫暖（20-24℃)、潔凈。病人在取精過程中須保持取精室周圍環境安靜，以免造成精神緊張引起取精困難。（2）常規精液采集方法:取精前患者丈夫先排尿沖洗下尿道，清洗雙手，將已寫上姓名及病歷號的取精杯交患者丈夫，并告知取精杯已消毒，勿污染杯內壁。丈夫手淫取精，應將全部精液射人取精杯，立即將杯蓋旋緊盡快送實驗室處理（30min內)。實驗室收到取精杯后應記錄收到時間、核對姓名及證件，并留取備查精液樣本（當患者面留取一滴精液于蓋夫妻手印的濾紙上)。如手淫取精不成功，可通過性交將精液收集于專用的無毒無菌避孕套內。 （3）逆行射精患者的精子采集方法:取精前夜（以21:00為宜）口服碳酸氫鈉（NaHC03)4g及200ml水，當日取精前1h再服4gNaHC03及200ml水，不可飲用提高尿液滲透壓的飲料，使尿液的滲透壓降低，最佳的尿液滲透壓范圍為280-320m0sm/L,尿液pH為6.8-8.5。取精前排空膀胱，手淫法射精后，立即將尿液排人盛有10mlHEPEs-精子洗滌液的取精杯內，盡快送實驗室處理。（4）陽萎或射精障礙患者的精液采集:陽萎或射精障礙患者可采取適當藥物治療和心理輔導，當治療無效時，可通過附睪精子抽吸術取精。3.精液處理指通過特定的方法，最大程度地從精液中分離出形態正常、活動力強的精子，同時，去掉精漿和精液中可能攜帶的微生物等。常用的分離方法有上游法和密度梯度離心法。前者用于精液質量較好的精子制備，后者精子回收率較高，更適合于少、弱精子癥患者的精子制備，且對精漿和其他成分的分離效果好，是更為常用的方法。（1）密度梯度離心法:該方法利用不同成熟度、不同狀態精子（如正常、畸形和死精子等）的密度差異，在特定介質形成的密度梯度場中進行離心分離，達到將正常、活動力強的精子與其他精子和精漿成分分離的目標。適用于精液參數正常、精液參數較差或凍存精液患者的精子處理。①場地與設備要求:精子處理應在無菌、恒溫的環境下操作。處理前應檢查生物顯微鏡、離心機、C02培養箱和超凈工作臺是否處在正常的工作狀態。相關的器材包括精子計數板，無菌的15ml離心管、注射器、Pasteur吸管須準備到位。②試劑準備:通常采用商品化的精子分離專用密度梯度分離試劑，最常用的體系是由40%上層和80%下層組成。所有分離用試劑和精子洗滌用培養基均需在使用前預熱到37℃，采用碳酸鹽緩沖系統的培養基應提前一天配制好放人C02培養箱中平衡。③操作流程:采集的精液置于37℃培養箱液化15-30min,混勻后無菌獲取10ul至精子計數板，按WH0-5標準進行精液檢查，計算前向運動精子總數。對精液不液化、液化時間長的樣本，加入等體積的精子洗滌培養基，立即檢查并處理。首先，用2ml注射器將1.0-2.0ml80%下層分離液置于15ml離心管底部，再將1.0-2.0ml40%上層分離液緩慢加在下層上，注意一定要在上下層之間形成明顯的分界。分離液量的多少與精子的載量呈正相關。用Pasteur吸管慢慢沿著管壁加入1.0-2.0ml液化精液，以免與分離液混合。300gx（15-20)min離心;用Pasteur吸管獲取離心管底部的精子沉淀于新的無菌離心管，重懸于5ml精子洗滌用培養基;200gx10min離心;5ml精子洗滌用培養基重復洗滌一次后;精子重懸于0.3-0.5ml培養基中，置于37℃培養箱備用，并測定精子的濃度和前向運動精子總數。④注意事項:精液有性傳播疾病等潛在的傳播風險，要按照生物安全流程操作和廢棄處理;有2份或以上樣本同時處理時須有全流程的2人核查和簽名;填寫實驗室精液處理記錄單，詳細填寫處理日期、方法、實驗室溫度、所使用試劑名稱和批號，處理前后精液的各項參數，計算前向精子的回收率。（2）上游法:上游法是利用活動精子在培養試管內自主向上的趨向泳動能力，從培養液的上層液面收集活動能力強的精子，把活動力差的精子、死精子、凝集的精子、其他細胞成分和精漿蛋白質等分離，達到優選精子的目的。①場地、設備和試劑準備:參見密度梯度離心法。②操作流程:將1ml精液，或將兩次洗滌以后的精子重懸于0.3-0.5ml培養基中，在精液或重懸液的上方，小心加入1ml培養基，將試管傾斜45。,置人37℃培養箱上游30-60min（時間根據精液質量來調整上游時間)，避免晃動。用無菌吸管吸取呈云霧狀上層液到另一支試管，再加培養液2ml混勻，200g