鎖陽藥材質量標準的研究

它也被稱為教母、蠶、鐵棒和鉤子。這是鎖陽科的鎖陽科cyodorius。寄生蟲索陽的干燥肉莖通常生長在魚科的白刺科。植物根部主要生長在干燥、堿性的沙地上。主要產于內蒙古、甘肅、青海、新疆等西北部。它是中蒙藥的常用場所。鎖陽味甘性溫,具有補腎益精、潤腸養筋之功效,中醫用于治療陽痿、遺精、不孕、腰膝酸軟、腸燥便秘等。現代藥理學研究表明,鎖陽具有提高機體免疫力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒、抑制血小板聚集等多種藥理活性。根據其主要的藥理作用,常艷旭等認為鎖陽中以兒茶素為代表的黃酮類,熊果酸為代表的三萜類,多糖及鞣質可以看作是指標性成分。《中國藥典》(Ⅰ部)2010年版中鎖陽含量測定指標未給予描述,不利于有效控制鎖陽藥材的質量。為此,我們采用反相高效液相色譜法建立了鎖陽藥材中兒茶素的含量測定方法,同時規定了其含量限度,并建立了鎖陽藥材的TLC鑒別方法,從而進一步完善其相關質量標準,為更好的開發利用鎖陽藥材這一西北地區豐富資源提供科學指導。1藥品、試劑與儀器SK5200HP科導超聲波清洗器;WP800SL23-2微波實驗儀(帶回流、磁力攪拌);UPT-I-5優普超純水機;RE-52旋轉蒸發儀;HH-6數顯恒溫水浴鍋;Agilent1200LC高效液相色譜儀;AG204電子分析天平;101A-2E電熱鼓風干燥箱;硅膠HSGF254薄層板(煙臺市芝罘黃務硅膠開發實驗廠)。兒茶素對照品(批號為877-200001,中國藥品生物制品檢定所);熊果酸對照品(批號為110709-200304,中國藥品生物制品檢定所);甲醇(色譜純,山東禹王試劑公司);超純水;磷酸(優級純,天津興華化學試劑廠);其余試劑均為分析純。鎖陽藥材分10批,于2010年7月采自青海、甘肅、內蒙古等西北部地區。經中國科學院西北高原生物研究所梅麗娟高級工程師鑒定為鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.。2方法和結果2.1熊羧酸的提取準確稱取干燥鎖陽粉末(過40目篩)適量置100ml燒杯中,按料液比1∶15(鎖陽質量與溶劑之比,g∶ml)加入醋酸乙酯,超聲提取40min,趁熱過濾,濾液減壓濃縮至1ml,作為樣品溶液。另取熊果酸對照品,加入甲醇制成每毫升含0.5mg熊果酸的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,用毛細管吸取0.5mg/ml的熊果酸對照品溶液和樣品溶液適量,分別點于同一硅膠HSGF254薄層板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水(20∶5∶1∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同的淺紫紅色斑點。薄層色譜圖如圖1所示,其中Rf值為0.33。2.2水分、總灰分的測定依據《中國藥典》2010年版(Ⅰ部)附錄規定的水分測定法第1法(烘干法)、灰分測定法,對鎖陽10個批次樣品進行水分、總灰分的測定。結果見表1。依照《中國藥典》中藥質量標準研究制定技術要求,并根據表1測定結果,按其平均值的±20%作為限度的制定幅度,初步制定限量標準:水分不得過12.0%,總灰分不得過14.0%。2.3特征組分的測定依據《中國藥典》2010年版(Ⅰ部)附錄規定的水溶性浸出物測定法項下的冷浸法、醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法,對鎖陽10個批次樣品進行水溶性浸出物、醇溶性浸出物的測定。測定結果見表1。根據表1測定結果,依照《中國藥典》中藥質量標準研究制定技術要求,按其平均值的±20%作為限度的制定幅度,初步制定限量標準:水溶性浸出物不得少于15.0%,醇溶性(95%乙醇)浸出物不得少于14.0%。2.4兒茶素的含量測定2.4.1流動相0.3%磷酸色譜柱為PLATISILTM-ODS(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-0.3%磷酸溶液(10∶90);流速1.0ml/min;柱溫30℃;檢測波長210nm;理論塔板數按兒茶素峰計算應不低于3000。2.4.2對照品溶液的制備精密稱取兒茶素對照品2.0mg置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解,稀釋至刻度,搖勻,得濃度為0.2mg/ml的兒茶素對照品溶液,過0.45μm的微孔濾膜后作為對照品溶液。2.4.3微波提取法準確稱取干燥鎖陽粉末(過40目篩)適量,置250ml平底燒瓶中,按料液比1∶6(g∶ml)加入70%乙醇,室溫浸泡約60min后微波加熱回流提取16min。趁熱過濾,取濾渣,再在相同條件下微波回流提取1次,趁熱過濾,收集2次過濾液減壓濃縮至小體積后,加甲醇定容至25ml,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。2.4.4標準曲線的繪制分別精密吸取對照品溶液1.0,2.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10.0,12.0μl,按上述色譜條件依次進樣,以進樣量(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為:Y=8991.2X+156.27(r=0.9998),兒茶素在0.2～2.4μg范圍內成良好的線性關系。對照品溶液與供試品溶液高效液相色譜圖見圖2。2.4.5條件穩定性測定分別精密吸取上述對照品溶液5.0μl,按上述色譜條件日內連續進樣5次,并測定5d,記錄兒茶素的峰面積。計算兒茶素的日內、日間RSD分別為0.81%和1.03%(n=5),表明儀器精密度良好。2.4.6峰面積測定取同一樣品(批號為100709)按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5.0μl,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測定,記錄兒茶素的峰面積。計算兒茶素含量的RSD為1.06%(n=5),表明實驗方法的重復性良好。2.4.7峰保留時間和相對峰面積取重復性試驗下的同一供試品溶液,分別在2,6,8,12,16,24h后按上述色譜條件測定,記錄兒茶素的峰面積,計算兒茶素峰的保留時間和相對峰面積。結果表明,兒茶素峰相對保留時間和相對峰面積穩定,計算RSD分別為1.43%和1.58%(n=6),表明樣品溶液至少在24h內穩定。2.4.8對照品溶液0.2.采用加樣回收法。取同一批樣品(批號為100709)適量,精密稱定,共5份,分別置250ml燒瓶中,精確加入一定量的兒茶素對照品溶液(0.2mg/ml),按樣品測定方法測定。結果見表2。2.4.9外標法計算兒茶素依“2.4.3”項下方法制備供試品溶液,分別精密吸取對照品溶液與不同批次供試品溶液各5μl,注入色譜儀,按外標法計算每批樣品中兒茶素含量。結果見表3。3討論3.1合理確定含量含量的樣品鎖陽多生長于干旱與鹽堿的沙地,因我國西北部地區有其獨特的資源地理環境優勢,所產鎖陽藥材質量較好,所以作者選擇了青海、甘肅、內蒙古等不同地點的10批次鎖陽藥材作為樣品,進行了相關質量標準研究,綜合考慮,規定鎖陽藥材中兒茶素的含量不得低于0.1%。3.2hplc法與tcl的區別3.2.1微波提取法比較了乙醇加熱回流提取法,乙醇微波回流提取法(帶磁力攪拌)和乙醇超聲提取法3種提取法。結果表明,10批次藥材微波法提取率均大于加熱回流法和超聲提取法,而且與其他提取方法相比,微波提取法熱效率高、升溫快速而均勻,能顯著縮短提取時間、提高效率,而且操作簡便快捷,溶劑消耗及廢物產生量低,故而被廣泛用于天然植物活性物質的提取中。實驗過程中比較了提取時間(8,12,16min)、料液比(1∶6,1∶10,1∶14)和乙醇濃度(60%、70%、80%)對鎖陽兒茶素提取率的影響。結果表明提取時間16min、料液比1∶6時提取率相對稍高,而乙醇濃度為70%時提取率高于60%和80%,因此,采用微波提取法,乙醇濃度為70%、料液比為1∶6時提取16min對樣品進行提取制樣。3.2.2流動相條件考察結果本實驗通過摸索乙腈與磷酸水溶液、甲醇與磷酸水溶液按一定比例混合作為流動相,考察其分離度,結果以乙腈-0.3%磷酸水溶液(10∶90)為流動相,流速1.0ml/min,柱溫30℃的色譜條件下樣品中兒茶素峰與其他共存組分峰能達到良好的分離。故本實驗最終確定此色譜條件。3.2.3本展開劑2:苯-醋酸乙酯-甲醛-水25555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555本實驗以熊果酸為對照品對鎖陽藥材進行薄層定性鑒定,操作簡便、結果可靠,薄層色譜圖清晰。通過對比不同比例的醋酸乙酯-甲酸(3∶1;4∶1;5∶1)、甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水(10∶5∶1∶1;15∶5∶1∶0.5;20∶5∶1∶0.5)及醋酸乙酯-甲酸-水(10∶2∶1),