課程設置學習情境設計載體檢測項目體液蛋白質檢測項目血脂代謝及檢測項目

糖代謝紊亂檢測項目鈉鉀氯和酸堿平衡檢測項目鈣、鎂、磷檢測項目臨床生物化學檢驗技術基礎物質代謝檢測疾病代謝異常檢測器官生理病理檢測肝膽生化及檢測項目

腎臟生化及檢測項目心臟損傷生化檢測項目胰腺生化的檢測項目內分泌功能紊亂及其檢測項目特殊生化檢測妊娠的生物化學檢驗項目新生兒的生物化學檢驗項目器官疾病對象物質載體必備知識1-酶學分析技術必備知識2-全過程質量控制必備知識3-方法學評價檢驗工作者必備知識3—

檢測系統評價與驗證天津市人民醫院宋志榮本章要點決定性方法、參考方法和常規方法的概念。檢測系統性能評價的臨床意義和臨床應用。精密度的概念，精密度實驗的評價方法。線性范圍評價的概念，實驗方法及數據分析。攜帶污染的概念，實驗方法及消除其措施。生物參考區間的驗證方法。室內與室間比對實驗的方法及實驗數據的統計分析檢測系統評價與驗證目錄第一節性能評價在實驗室的應用范圍第二節性能評價與驗證的基本方法第三節室內與室間比對實驗

第一節性能評價在實驗室的應用范圍檢測系統評價與驗證常規方法決定性方法經詳盡研究尚未發現產生誤差的原因準確度最高，系統誤差最小，測定結果與“真值”最為接近。主要用于評價參考方法和對一級標準品定級。經詳盡研究證實其不準確度與不精密度可以忽略的方法。主要用于鑒定常規方法的準確性，也用于鑒定二級標準品、對質控血清定值和對商品試劑盒的質量做評價等。應具有足夠的精密度、準確度和特異性，有適當的分系范圍，其性能指標符合臨床或其他的需要，經濟實用。實驗室方法分級參考方法一、實驗室方法分級臨床檢驗部分項目的方法分析物決定性方法參考方法常規方法CaID-MS原子吸收分光光度法鄰甲酚酞絡合酮法、MTB法ClID-MS中子活化法電流滴定法硫氰酸汞法、選擇性電極法KID-MS中子活化法火焰光度法火焰光度法、離子選擇電極法Na重量分析法中子活化法火焰光度法離子選擇電極法火焰光度法分析物決定性方法參考方法常規方法UreaID-MS尿素酶法二乙酰一肟尿素酶法GLUID-MS己糖激酶法葡萄糖氧化酶法TBIL-重氮法J-G法ALB-免疫化學法溴甲酚綠法TP-凱氏定氮法雙縮脲法臨床檢驗部分項目的方法項目名稱決定性方法參考方法常規方法HbA1c-IFCCNGSP色譜免疫血細胞計數-ICSH血細胞分析儀臨床檢驗部分項目的方法常規方法參考方法決定性方法應用范圍不同方法間的關系性能評價的必要性：每種檢測項目具有多種檢測方法；各室用試劑、標準品、質控品及其它外部供應品來源不同儀器、人員素質和技術管理之間有很大差別等；同一檢驗項目各實驗室的檢測結果之間相差很大，給臨床的診斷和治療造成了一定的困難。★為保證檢驗結果準確可靠，增加實驗室之間的可比性二、性能評價的應用范圍

性能評價的臨床應用范圍新檢測方法檢測系統在運行過程中新建檢測系統配套系統：實驗室對照生產廠家提供的儀器使用說明書的承諾進行性能參數的驗證。非配套系統：實驗室必須對其性能進行全面評價。一個穩定的檢測系統必須保證其檢測誤差在臨床可接受的范圍內。檢測系統在運行過程中由于機械部件的磨損、材料變質，檢測系統的組成發生變化或檢測系統的運行環境發生變化時，各種性能也會隨之發生變化。為了保證檢測系統的持續有效性，必須定期或不定期的評價或驗證。性能評價和驗證?儀器停修后再次使用檢測方法變更檢測試劑變更新項目在應用臨床之前對新檢測方法一個新的檢測方法的引進或對原有檢測方法的某些技術進行改進以后，在對臨床標本檢測以前都要進行性能評價。完全符合臨床使用要求時方可用于患者標本進行檢測。性能評價驗證精密度準確度線性范圍攜帶污染率標準化生物參考區間What?檢測系統評價與驗證第二節性能評價與驗證的基本方法精密度：是指同一標本在一定條件下多次重復測定得到的一系列單次測定值之間的接近程度。通常用標準差（S）和（或）變異系數（CV）的大小表示，S和CV愈大表明檢測結果之間的離散程度愈大，重復性愈差；SD和CV愈小表明重復性愈好。

精密度評價批內精密度：在重復性條件下，在盡可能短的時間內對同一樣本進行多次重復測定所得結果的接近程度。日間精密度：將同一樣本分成數份，用同樣方法每天測定一次，最少連續測定20天求得的精密度。精密度評價實驗實驗條件必須保證穩定檢測系統組成的穩定，室內環境基本符合日常工作要求，實驗方法以及試劑、質控品、校準品批號一致。實驗樣本應與真實標本有同樣的基質且穩定性好選擇2個或多個濃度患者血清或冰凍血清或以血清為基質的質控品或校準品。檢測系統應處于良好的狀態其運行環境和條件應在儀器使用說明書規定范圍之內。每次實驗過程均應有質量控制。實驗前準備批內精密度測定：將實驗樣本隨機插入患者樣本中進行檢測，一批內連續測定20次。日間精密度測定：每天將實驗樣本隨機插入患者樣本中檢測一次，20天后對20次檢測結果進行統計分析。計算高、低兩個濃度批內與日間共4組數據的均值、標準差和變異系數。樣本測定實驗數據統計分析公式為：

式中指在該符號右側求總和；i=1表示從第1個x值開始加，加到第n個x值，一共加n個。項目名稱質控物水平變異系數％衛生部規定的允許誤差范圍的1/4GLUN0.392.5H0.482.5批內≤1/4衛生部臨檢中心規定的總允許誤差范圍

日間≤1/3衛生部臨檢中心規定的總允許誤差范圍精密度實驗判斷標準項目名稱質控物水平變異系數％衛生部規定的允許誤差范圍的1/3GLUN0.743.33H0.583.33定義：準確度是指測定值（或一組數據的均值）與真值的一致性，用偏倚來表示。偏倚又可用系統誤差的大小來表示。評價系統誤差的實驗：回收試驗：是評價比例系統誤差干擾試驗：是評價恒定系統誤差方法比較試驗：是評價系統誤差（恒定和/比例誤差）

準確度評價定義：是指在已知濃度的樣本中加入不同濃度的已知被測物，用被評價方法或被評價檢測系統測定被評價物質的濃度，最后計算實測濃度與加入濃度之比，以回收率評價實驗方法或檢測系統的比例系統誤差。方法：無溶血、無脂血、無黃疸正常人血清，將其一分為三，一號樣本作為基礎樣本；二號和三號樣本作為分析樣本。分析樣本中加入不同濃度的被分析的純品標準液，基礎樣本中加入相同體積的無分析物的溶液，使3份樣本的總體積相同，重復檢測4次，計算回收率。回收實驗計算公式：

回收濃度=分析樣本測得平均濃度－基礎樣本測得平均濃度

加入濃度=加入的標準液量（ml）×標準液濃度患者樣本量（ml）標準液量（ml）回收率（%）=回收濃度×100加入濃度比例系統誤差=100%－平均回收率＋回收實驗例如：用某被評價的檢測系統

測定血清葡萄糖來做回收實驗基礎樣本：血清0.9ml+0.1ml生理鹽水分析樣本1：混合血清0.9ml+0.1ml50mmol/L葡萄糖標準液分析樣本2：混合血清0.9ml+0.1ml100mmol/L葡萄糖標準液用被評價的檢測系統對該樣本進行四次重復檢測計算回收率和比例系統誤差小于衛生部規定的TEa標準，說明此方法的準確度性能可接受；大于不可接受。例如：用某被評價的檢測系統測定

血清葡萄糖來做回收實驗

測得平均濃度

加入濃度

回收濃度

回收率

（mmol/L）

（mmol/L）

（mmol/L）

（%）基礎樣本

2.0---分析樣本16.85.04.896分析樣本211.710.09.797

（平均）

96.5回收實驗檢測結果結論：平均回收率為96.5%，比例系統誤差為3.5%，小于衛生部規定的總允許誤差標準，該方法的準確度性能可接受。新鮮正常人混合血清；應將被測物配制適當濃度的溶液加入實驗樣本中，一般不超過總體積的10%；樣本加入量必須一致，且有高、中、低濃度；加入的濃度必須包括醫學決定水平，但不超出本方法的線性范圍；試劑配制和加入量必須準確，要多做幾次后作出評定。注意事項定義：是通過定量檢測樣本中的物質所引起實驗方法的系統誤差，以評價方法的準確度。首先要確定被試可疑物質是否引起誤差；若能引起誤差,再進一步探討其誤差的來源是因方法特異性差還是干擾造成。若加入的物質本身和分析試劑反應并產生讀數，這是特異性差；若加人物質并不與分析試劑反應，但它改變了分析物和分析試劑間的反應，這是干擾。干擾實驗臨床生化常見干擾物來源：內源性：標本中存在的（血清固有、病理情況生成的代謝產物、藥物、標本采集不當或飲食造成干擾物）外源性：加入標本中的（抗凝劑、防腐劑、穩定劑以及采集和處理標本過程中污染物）干擾實驗可疑干擾物的選擇：可根據實驗方法的反應原理、廠商的說明書、文獻資料選擇。常見的干擾物包括黃疸、脂血、溶血、防腐劑、抗凝劑、穩定劑和某些藥物等。干擾物的制備：如在樣本中加入膽紅素標準品可制備黃疸標本，用機械溶血可制備溶血標本、通過添加商品的脂肪乳制備脂血標本等。干擾實驗方法實驗樣本制備：選用正常患者標本，將其一分為二，在其中一份樣本加入一定量的可疑干擾物質作為干擾樣本，在另一份加入同等量的不含任何干擾物的溶劑作為基礎樣本。干擾實驗方法干擾樣本基礎樣本

樣本檢測：用被評價的方法或被評價的檢測系統對每份樣本重復測定2～3次，求添加干擾物后的每個混合血清與添加空白液的混合血清的偏差和百分偏差。干擾值計算干擾值（mmol/L）=干擾管測定值－基礎管測定值干擾率計算干擾率（%）=（干擾值/基礎值）×100%判斷標準：將干擾引起的系統誤差的大小與衛生部TEa進行比較，若小于該標準即可接受。干擾實驗方法樣本制備：制備正常人混合血清一份，將其一分為二，

1號為基礎樣本，2號為干擾樣本。基礎樣本：混合血清0.9ml+蒸餾水0.1ml干擾樣本：混合血清0.9ml+8.84mmol/L尿酸標準液0.1ml干擾實驗檢測結果例如：評價尿酸對GOD-POD法

測定血糖的干擾

葡萄糖測定均值

加入尿酸濃度

干擾物濃度

（mmol/L）

（mmol/L）

（mmol/L）

基礎樣本

6.56—

—干擾樣本

7.180.88

0.62結論：0.88mmol/L尿酸對血糖的干擾值為0.62mmol/L，小于衛生部臨檢中心TEa，判斷其是可接受的。控制干擾物的加入量：加入干擾物的數量應不超過實驗樣本總體積的l0%。確定干擾物濃度：加入干擾物的濃度須達到有價值的水平，盡可能達到病理標本的最高濃度值。確定干擾的標準：由于干擾物引起測定結果的偏差有大有小，究竟多大的干擾可影響臨床診斷和治療，這個標準至今仍未確定。注意事項空白實驗采用雙波長或多波長檢測排除干擾。當誤差較大又無法消除時，應對檢測方法進行改進或更換新的檢測方法。

消除干擾的常用方法新的檢測系統新的檢測方法實驗方法Y原有的檢測系統公認的檢測方法比較方法X患者標本偏倚方法比較實驗熟悉分析方法和分析過程：對檢測系統流程、方法、儀器、環境、消耗品使用以及評價的內容和方案十分熟悉和了解。檢測系統應處于良好狀態，檢測系統運行環境和條件在控制范圍內，每次要有質量控制。樣本準備：20份患者新鮮樣本，其所含分析物濃度必須分布于實驗方法的檢測范圍內，其中至少50%樣本的測定結果處于實驗室的參考區間之外、線性之內。方法比較實驗樣本檢測：用實驗方法和比較方法每天對5-7份樣本進行檢測，共檢測3-5天。每份樣本在每臺儀器上雙份測定（隨機指定第一次測定順序，按反向順序檢測第二次），取平均值。統計分析：比較方法X，實驗方法Y。將20對結果繪制于坐標紙上，如所有樣本方法學間比較的結果呈良好的直線線性關系，說明方法學比較實驗有效。使用直線回歸處理，計算y=bx+a及相關系數r。實驗數據的統計分析評價標準：相關系數r≥0.975，說明回歸式可以較好的反映方法間的真實關系，則在所檢測的分析物濃度范圍內的任何處，可以估計方法學偏倚，偏倚應≤1/2TEa。室間質量評價驗證：參加權威機構組織室間質量評價定值標準品的驗證：質控血清、校準品、EQA剩余標本室內比對驗證：同一個實驗室內部有公認的方法或公認的檢測系統做同一個檢驗項目，可以用公認的方法或檢測系統的結果比較其準確度。室間比對驗證：用本室的測定值與參考實驗室的檢測結果進行比對，觀察同一個樣品測定值間的差異。

準確度驗證準確度與正確度、精密度的關系圖例AC線性段線性范圍評價：是觀察一種檢測方法或一個檢測系統的檢測范圍。通過該實驗可以了解其最高檢測值（上限）和最低檢測值（下限），是對患者檢測結果可報告范圍的一種評價。較好的實驗方法或檢測系統應有一個較寬的線性范圍，起碼應覆蓋本項目的醫學決定水平和常見疾病的檢測值。目的：選擇線性段作為該測定方法的分析測量范圍。線性范圍評價標本：患者新鮮低值和高值血清標本最高濃度樣本：至少高于可報告范圍上限30%。最低濃度樣本：盡量選擇接近線性范圍下限，低值有臨床意義的項目，應選擇盡量低的標本。系列濃度樣本準備1號樣本：原低值樣本2號樣本：低值樣本︰高值樣本=4︰1比例混勻3號樣本：低值樣本︰高值樣本=3︰2比例混勻4號樣本：低值樣本︰高值樣本=2︰3比例混勻5號樣本：低值樣本︰高值樣本=1︰4比例混勻6號樣本:原高值樣本實驗前準備系列濃度樣本在一天內分兩批進行測定，第一批測定順序從低到高濃度，第二批測定順序從高到低濃度，每批樣本測定3次，計算實測平均值。根據樣本稀釋方案計算預期值。

樣本的檢測將實測均值（Y軸）與預期值（X軸）作比較，初步觀察其相關性、線性走向及線性范圍。直線回歸統計，計算y=a+bx及相關系數r或r2。評價標準：b在1±0.05范圍內且相關系數r≥0.975，認為以上6個濃度為被評價方法或被評價檢測系統的線性范圍。實驗數據統計分析系列濃度預期值實測平均值110132233199345541346786395900830611231019

課間休息定義：是指分析儀器檢測標本時，由于試劑、樣本和反應杯等殘留物對后續項目檢測結果的影響。現代分析儀器共用樣本加樣針、試劑加樣針、反應杯、攪拌棒等。共用部件殘留物對后面標本檢測結果的影響有些時候是非常明顯的，甚至造成臨床不可接受的結果。攜帶污染率的評價熟悉分析方法：對檢測系統的流程、方法、儀器、環境、消耗品使用以及評價的內容和方案十分熟悉。檢測系統應處于良好運行狀態。樣本：無溶血、黃疸、脂血的高、低濃度各一份。檢測方法：取4個樣本杯，分別盛放3個相同低濃度的標本（分別為L1，L2，L3）和1個高濃度標本（H）。按L1，L2，H，L3順序進行測定。攜帶污染率的計算：攜帶污染率=(L3-L2)/H×100%攜帶污染率的評價攜帶污染率的評價加強對分析儀器的日常維護和保養研究新方法：用雙試劑或多試劑消除或降低攜帶污染率。針對性解決問題：對污染的項目從分析原理、試劑組成等多方面進行分析。改變分析方法：當攜帶污染難以解決時。其他方法：改變試劑加樣順序、插入非干擾項目、先檢測無污染的項目、相互干擾的項目分別指定使用不同圈的比色杯（生化分析儀的內圈或外圈比色杯）、采用雙試劑加樣針分別加入試劑等。消除攜帶污染率常用措施良好的精密度，無樣本的攜帶污染是我們進行其它方法學驗證的前提，如果一個分析系統的重復性不好或存在著樣本攜帶污染，則其它的方法學評價實驗就缺乏基本保障。注意定義：是指某項檢查結果在正常人群中的分布范圍，是解釋檢驗結果、分析檢驗信息的一個基本尺度和依據。國內實驗室多引用國家權威機構、權威刊物頒布的或直接引用試劑廠家提供的生物參考區間。由于國度、年齡、性別、民族、居住地、生活習慣等存在差異，引用的參考區間與本地居民實際的可能有一定差異。生物參考區間的驗證選擇評價對象：選擇無任何已知疾病，近期內未用任何藥物的健康自愿者20名。必要時可按性別和不同年齡段進行分組，每組至少20名。采集標本：應排除影響檢測結果的一些因素。如血液標本應禁食8-12小時，采血前不能飲用任何飲品、不能服用任何的藥物、禁煙、避免劇烈運動等。合理選擇采血時間、采血方法、采血次序、加入抗凝劑的類別等。檢測方法：按實驗室制定SOP文件要求檢測20例健康個體。20個檢測數據不應在一天內獲得，建議當天標本當天測定。實驗前的準備若實驗對象的測定值有95%以上在所選擇的參考區間內，可以接受。即：若20例檢測結果全部在該參考區間內；或有1例檢測結果在該區間以外，選擇區間可以接受；若2例或2例以上超出該參考區間，應再增加20例健康個體重新進行驗證，若有10%的檢測結果超出參考區間，應考慮重新制定本實驗室的生物參考區間。生物參考區間結果評價檢測系統評價與驗證

第三節室內與室間比對實驗

定義：同一檢驗項目在同一實驗室用兩種或兩種以上的檢測系統檢測，檢測結果之間要有可比性。常用方法：被評價的檢測系統與本實驗室完整有效的國際國內公認的檢測系統或參加室間質評成績合格的檢測系統進行比對。室內比對定義：為了保證本室檢測結果的準確可靠。實驗室將本室的檢測結果與參考實驗室或經ISO15189認可的實驗室的檢測結果進行比對，或者參加權威機構組織的室間質量評價，這樣的比對稱“室間比對”。室間與室內比對實際上是兩個或多個檢測系統的方法比較實驗，待評價或驗證的方法為實驗方法，參考方法或準確度已知的方法為比較方法。室間比對選擇患者血液樣本至少40例，最好包括臨床常見的各種疾病的標本。濃度范圍盡可能覆蓋整個可報告范圍，其中至少50%樣本的測定結果處于實驗室的參考區間之外、線性之內。如果從一個患者得不到所需要的樣本量，可以將兩個（但不能多于兩個）病史相同，被測物濃度也大致相近的患者樣本混合使用。最好使用測定當天的樣本。比對樣本收集每天測8個樣本，連續測定5天，每個樣本在每臺儀器上雙份測定，按正反各一次的排序進行檢測（隨機排序）如：第一次序號為：1、2、3、4、5、6、7、8第二次序號為：8、7、6、5、4、3、2、1比對的全部標本，均應在兩個小時內測定完畢。減少交叉污染及漂移對重復測定標本平均值的影響比對樣本測定實驗數據統計分析t檢驗相關系數分析直線回歸分析F檢驗方法比較實驗所得的結果是配對資料t檢驗：用于比較兩種方法間的系統誤差（對隨機和比

例誤差敏感），用偏差表示。F檢驗：用于比較方法間的隨機誤差或精密度。相關系數（r）：對隨機誤差敏感，r越接近1表明兩者相關性越好；r≥0.975或r2≥0.95則認為兩者有相關性。直線回歸分析：Y=a+bxa為回歸線截距對恒定誤差敏感，a=0時表示無恒定誤差b為回歸線斜率對比例誤差敏感；b=1時表示無比例誤差配對資料統計處理r≥0.975或r2≥0.95提示兩個檢測系統的結果有可比性；室內比對偏差小于可接受范圍，說明被評價的檢測系統的檢測結果可以接受，反之為不可接受，室間比對相對偏差不能超過1/2衛生部TEa可接受范圍。判斷標準儀器比對儀器被評價儀器雅培C16000全自動生化分析儀東芝TBA-120FR(A機)樣本號比對方法被評價方法第一次第二次均值第一次第二次均值18.89.2911.511.511.528887.487.791.591.891.65318.818.518.6522.122.322.242.22.62.46.15.65.85538.438.938.6539.439.639.56134.2134.3134.25142.5143.3142.97230.5232.5231.5240.1240.9240.583.43.43.44.84.84.896.67.57.058.58.48.451010.510.410.4513.713.513.61118.117.617.8522.421.722.051214.118.516.317.416.717.05136.76.46.558.88.88.81425.224.82527.72