金銀花中綠原酸不同提取方法的比較研究

金銀花具有清熱解毒、抗菌消炎、益螨散腫、涼血止瀉的功效。而綠原酸是迄今為止從金銀花中發現的藥理活性最強的成分之一,是金銀花的主要特征成分和有效成分,通常被作為定性分析甚至定量分析的指標。據文獻報道,提取金銀花中的綠原酸主要有如下幾種方法:浸漬法、滲漉法、熱回流法、超聲波法、微波法和酶法。試驗采用熱回流法和超聲波法分別對金銀花中的綠原酸進行了提取,并利用熱回流法分別測定了花苞及全開花中綠原酸的含量,以期為綜合評價金銀花藥材質量提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1黃州區康健大藥房金銀花(LONICERAEJAPONICAEFLOS),購自黃岡市黃州區康健大藥房康健大藥房;新鮮金銀花,采自黃岡師范學院植物園,經鑒定為正品。1.1.2儀器和檢測方法電子分析天平,購自北京賽多利斯儀器系統有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵,均購自上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、KQ-B玻璃儀器氣流烘干器,均購自鞏義市英峪予華儀器廠;UV-3802型紫外可見分光光度計,購自尤尼可上海儀器有限公司;KQ-5200B型超聲清洗儀,購自昆山市超聲儀器有限公司。1.1.3試劑和試劑綠原酸標準品,購自天津一方科技有限公司;乙酸乙酯(分析純)、石油醚(分析純)、無水乙醇(分析純)和甲醇(分析純),均購自天津市凱通化學試劑有限公司。1.2方法1.2.1提取下層液體將所購金銀花干品粉碎過10目的篩子,準確稱取金銀花粉末5.000g于100ml濃度75%的乙醇溶液中浸泡24h。次日,架好回流裝置,溫度定為90℃,回流提取1.5h。回流結束后,倒出上層清液,殘渣再加入100ml濃度75%的乙醇溶液繼續回流提取1.5h。合并濾液,真空抽濾2次,真空度為0.095MPa。將濾液轉移至500ml的圓底燒瓶中,后用旋轉蒸發儀將濾液濃縮至無液滴產生為止,此時,溫度定為45℃。濃縮完成后,約剩下40ml的濃縮液。將濃縮液轉移至分液漏斗中,用適量石油醚脫色處理2次,再用適量的乙酸乙酯萃取4次,以上步驟均取下層液體。萃取完成后,將下層棕色液體轉移至100ml的容量瓶中,用濃度50%的甲醇溶液定容,再取0.5ml定容至50ml,靜置備用。1.2.2乙醇溶液的浸泡將所購金銀花干品粉碎過10目的篩子,準確稱取金銀花粉末5.000g于100ml濃度75%的乙醇溶液中浸泡24h。次日,于60℃下超聲提取35min,結束后,倒出上層清液,殘渣再加100ml濃度75%的乙醇溶液繼續超聲提取35min,合并濾液。以下操作同“1.2.1”中操作步驟。1.2.3標準品溶液的制備準確稱取7.2mg綠原酸標準品,用濃度50%的甲醇溶液在超聲條件下使其完全溶解,并定容至25ml,得到濃度為0.288mg/ml的標準品溶液。1.2.4提取下層液體從黃岡師范學院植物園摘取一定數量的金銀花花苞(圖1),稱取5.000g濕品,粉碎后置于100ml濃度75%的乙醇溶液中浸泡24h。次日,架好回流裝置,溫度定為90℃回流提取1.5h。回流結束后,倒出上層清液,殘渣再加100ml濃度75%的乙醇溶液繼續回流提取1.5h。合并濾液,真空抽濾2次,真空度為0.095MPa。將濾液轉移至500ml的圓底燒瓶中,后用旋轉蒸發儀將濾液濃縮至無液滴產生為止,此時,溫度定為45℃。濃縮完成后,約剩下40ml的濃縮液。將濃縮液轉移至分液漏斗中,用適量的石油醚脫色處理2次,再用適量的乙酸乙酯萃取4次,以上步驟均取下層液體。萃取完成后,將下層棕色液體轉移至100ml的容量瓶中,用濃度50%的甲醇溶液定容,再取5ml定容至50ml,靜置備用。1.2.5從花蕾中提取綠色原酸的含量從黃岡師范學院植物園摘取一定數量的金銀花花苞(圖1),操作同“1.2.4”中的操作。1.2.6空白溶液吸收曲線取濃度50%的甲醇水溶液作為空白對照,選定掃描范圍為190～900nm,先掃一個空白溶液的吸收曲線。校正空白后,將掃描位置推至標準品溶液處,掃描范圍仍為190～900nm,得出一個標準品溶液的吸收曲線,選擇最大吸收波長。1.2.7標準品溶液的測定分別取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5ml對照品溶液于25ml容量瓶中,用濃度50%的甲醇溶液定容至刻度,然后選定吸收波長為327nm,在紫外分光光度計中測定標準品溶液的吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,作綠原酸標準曲線。1.2.8綠原酸的含量是測量的選定吸收波長為327nm,在紫外分光光度計中測定各供試品溶液的吸光度,連續進樣3次,然后根據標準曲線計算出綠原酸的含量。2結果與分析2.1吸收最大波長的確定由圖2可知,標準品溶液在327nm處有最大吸收峰,故綠原酸的最大吸收波長為327nm,選擇327nm作為吸收波長。2.2綠原酸的測定通過計算繪制出標準曲線為Y=50.885X+0.2867,相關度R2=0.9984,表明綠原酸在5.76～28.80μg/ml濃度范圍內線性關系良好。2.3乙醇回流法與超聲提取法提取率的比較由表1可知,以乙醇回流法提取的金銀花原液中綠原酸濃度為1.905mg/ml,含量為3.81%,而以超聲提取法提取的金銀花原液中綠原酸濃度為1.306mg/ml,含量為2.61%,故乙醇回流法比超聲提取法提取率更高一些;以乙醇回流法提取的全開金銀花原液中綠原酸濃度為0.1677mg/ml,含量為0.34%,而以乙醇回流法提取的花苞原液中綠原酸濃度為0.2601mg/ml,含量為0.52%,故花苞中的綠原酸含量要高一些。3討論(1)超聲提取條件對綠原酸提取率的影響經查閱相關文獻,一般的超聲提取試驗,均用到的是超聲發生器,頻率在4000kHz不等,而該試驗所用的為超聲清洗儀,頻率為40kHz。對比研究發現,試驗中用到的是超聲清洗儀的論文中,綠原酸的提取率在1.90%～3.58%。而該試驗中,超聲提取法的綠原酸含量為2.61%,在正常范圍內。只有在個別超聲提取率的探究性試驗中綠原酸的提取率在5%以上,這說明超聲提取條件對提取率的影響很大。參考相關文獻發現,各因素影響金銀花中綠原酸的提取率的主次關系為pH值>預浸時間>超聲時間>乙醇濃度。試驗中也探究了一下pH對綠原酸提取率的影響,發現當pH為2時的吸光度很低,只有0.383,而且提取液呈棕褐色,即在酸性條件下綠原酸的酯鍵發生了水解,故在327nm波長處吸光度下降。這也從側面說明金銀花中綠原酸超聲提取的條件很苛刻,對于乙醇回流法,正常情況下,金銀花中綠原酸含量在3.5%～5.5%,試驗結果為3.96%,在正常范圍內。(2)測定金銀花的含量試驗中全開花中的綠原酸含量少于花苞中綠原酸含量,原因是花開后花蕊直接受陽光的照射,而綠原酸受陽光的照射易分解,故含量有所降低。因此,從試驗測定結果看,中國藥典規定以花蕾或帶初開的花入藥對控制制劑質量是有必要的。另外,因新鮮金銀花的吸光度太低,故將金銀花供試液稀釋了10倍,使其吸光度在標準曲線的線性范圍之內。新鮮金銀花中綠原酸吸光度數值為烘干金