利用基因組技術生產轉基因動物的基因打靶技術

將一些dna段插入動物細胞后，它們可以定位并與內源級同源序列進行重組。這種基因重組被稱為基因問題。基因打靶技術可以用來生產轉基因動物。在小鼠胚胎干細胞中應用這一技術已生產出各種不同基因位點的突變體,可對小鼠中特異性基因的表型進行評價。基因打靶技術不只是一種使基因失活的手段,而且可作為一種用來改變基因活性的方法。1基于dna的同源重組第1個攜帶有外源性基因的動物是將逆轉錄病毒——猿猴病毒40(SV40)DNA注射到小鼠的胚泡腔中產生的,但這些小鼠并沒有將SV40DNA整合到它們的生殖細胞中。第1次基因打靶實驗是用一種可選擇的人工位點的成纖維細胞系進行的。在小鼠中,已做了大量的工作,并產生了各種突變體,另外,也有人通過使用純化基因DNA而使同源重組的效率提高。雖然,已經證明未經純化的DNA同樣成功的在小鼠胚胎干細胞和小鼠體細胞中進行打靶,但是很明顯的使用基因純化的DNA時,重組的效率得到了很大的提高。純化基因DNA,即同被打靶的DNA具有100%,這在高度近交的實驗小鼠中并不是問題,但對于所有種類的遠交家畜來說,確是至關重要的一個問題。為了克服這一問題,維持打靶基因的純化率,依賴于一種long-rangePCR技術,這一技術基于DNA聚合酶的重組,能產生35kb大的擴增子,比同源化的長度更重要的是酶的正確性相當的高,要達到錯誤率僅為1bp/100kb。有人發現Pfu1作為一種編輯和糾正的酶,錯誤率可以控制在可接受的范圍內。但是對于純化基因片段產生的實際速度和難易程度來說,還依靠對于想要的基因所知的序列信息量。2基因沖突法適用于大型動物2.1核移植體的基因敲除增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)比野生型GFP基因更適合用來作為一種報道基因,因為野生型的GFP基因在哺乳動物細胞中表達水平很低,EGFP的表達可在活細胞中被檢測到,所以,有人將EGFP基因和NeoR通過一種逆轉錄病毒載體系統轉化到豬胎兒成纖維細胞中,轉染的豬胎兒成纖維細胞經過核移植后,構建的胚胎成功的發育到胚泡期。這些胚胎在2細胞,4細胞,桑葚胚及胚泡期的細胞質中表達EGFP,并且沒有鑲嵌現象,這一結果也說明了EGFP基因可以作為一種識別胚胎移植前的轉基因核移植后的豬胚胎的標志物。有人將胎兒來源的成纖維細胞用含有EGFP的復制缺陷型載體進行轉染,轉染后的細胞用秋水仙素進行處理(秋水仙素-使細胞同步進入G2/M期),然后將這些細胞作為核供體進行核移植,將細胞核注射到體外成熟的去核的豬卵母細胞的卵周隙中,融合并用電脈沖激活。融合后2小時,在大多數的重構卵中均可檢測到熒光。在所有的核移植胚胎中,融合后15小時熒光變弱,當培養到48h后,熒光消失,但從第3天起,在2細胞,4細胞時期的胚胎中又開始表達EGFP。將200個1細胞時期的重構胚移植到4只受體中,其中有3只動物懷孕,并且有1只受體豬產下1個健康的表達EGFP的轉基因后代。在豬向靈長類動物進行器官移植的過程中,存在著的主要的障礙就是豬細胞表面的末端1,3半乳糖基(Gal)使異源移植過程中發生免疫排斥反應,導致失敗的器官移植。為了能夠克服在異源移植過程中由于Gal的存在而引起的排斥反應,賴良學等人通過敲除1,3半乳糖基轉移酶(GGTA1)位點而產生了4頭此基因被敲除的豬。1,3半乳糖基轉移酶(GGTA1)位點的敲除可以提供永久的和完全的保護。通過胚胎干細胞工程成功的獲得了此基因被敲除的小鼠,但對于有些家畜來說,還不能輕易的獲得ES細胞,所以,體細胞核移植技術的發展為在大動物中進行基因的定點修飾提供了可能。在這一實驗中,研究者選擇在一高度近交的主要組織相容性復合體限定的小型豬系中進行GGTA1位點的敲除,這樣大小的豬對于進行臨床的器官移植非常適合。用一種基因捕獲打靶載體pGalGT來對一內源性的GGTA1等位基因進行同源的置換,載體包含有約21kb大小的與GGTA1位點同源的序列,對17個克隆進行分析后,發現有8個包含有想象中的重組事件。獲得的這幾頭基因敲除豬是利用了核移植技術,選擇經過基因修飾過的克隆的胎兒成纖維細胞系作為核的供體,與去核的豬卵母細胞進行胚胎的構建。也有人用以一種細菌毒素為基礎的選擇過程來篩選細胞,在這些細胞中,Gal基因的第2個等位基因被敲除掉。序列分析顯示,Gal基因的第2個等位基因的敲除是由于1個在外顯子9的第2個堿基上的T到G的單個位點突變引起的,這可以導致Gal蛋白的活性喪失,通過3輪連續的克隆獲得4只健康的Gal1、3GT雙敲除的雌性小豬。還有人用2種其他的方法成功的產生出了GalT+/-的豬胎兒成纖維細胞。一種是用一基因純化的打靶構建體進行的正的陰性選擇物,另一種是使用帶有非純化DNA的無啟動子載體。迷你型豬由于它的體型小,以及與人在生理上具有某種相似性,對于醫學和藥理學的研究意義重大,所以對于轉基因的迷你型豬的研究也就變得很有價值了。首次成功的報道轉基因迷你型豬的獲得是通過原核顯微注射的方法實現的,從迷你型豬克隆得到的huntingtin基因與大鼠的神經元特異性的烯醇化酶的啟動子區域相結合,通過顯微操作儀注射到受精卵的原核中,將受精卵再移植到這種豬的輸卵管中,通過PCR和Southern分析,成功的產出了5只具有轉基因特性的后代。2.2-actingfp的電融合與同源重組經過基因修飾后的牛具有重要的農業和人類醫藥價值。有人用體外培養的轉基因的胎兒細胞系進行核移植,成功的獲得了后代小牛,這證明了產生轉基因克隆牛的可能性,并且用成體的顆粒細胞作為核供體進行移植也同樣能成功的產生克隆牛,所以有人也嘗試用此細胞類型來產生轉基因的克隆牛。他們將一含有EGFP基因的質粒轉染細胞,核移植后的胚胎可以發育到胚泡期,并且通過研究發現,晚期的轉基因成體細胞要比早期細胞更適合作為核供體。已知所有物種中的精子細胞都可以結合蛋白和DNA,因此,能用它們來作為載體,將外源的DNA在受精過程中導入卵母細胞中,外源DNA既能整合到精子染色體DNA中,又能通過精子轉導到卵中,并且隨后可整合到受精卵的基因組中。有人將牛的精子與Pst1β-actinGFPDNA構建體進行電融合,這樣能將這段DNA轉化到體外受精后的胚胎中。研究發現,電融合的過程本身并不影響體外胚胎的發育,然而,經過電融合的DNA處理的精子進行受精后的卵母細胞發育到16細胞時期的比例卻相當的低。但另一方面,電融合的使用可大大提高DNA的吸收。通過PCR檢測得出結論,電融合后發生同源重組的效率要遠遠高于非電融合后的同源重組。用限制型性內切酶介導的基因插入方法能獲得轉基因的牛精子,即用Not1-線性化的pEGFP和其相關的限制性酶對牛的精子細胞進行脂質轉染。將目的片段整合到精子基因組DNA中,然后用這種精子進行體外受精,產生的桑葚胚能夠表達GFP。當將轉基因的精子用來做人工授精時,產生的小牛在它們的淋巴細胞中檢測到外源DNA的表達。結果顯示,限制性內切酶介導的基因插入是一種產生轉基因精子,通過人工授精產生后代或通過體外受精產生胚胎的有效方法。將哺乳動物的人工染色體導入受精卵中是一種可行的且更有前景的產生重組蛋白的方法。哺乳動物人工染色體可以沿著受體染色體復制,而不會整合到同源的基因組中,并且有能力運載大量的經過設計后的帶有調節區域的DNA片段,這種調節區域可以使基因進行組織特異性和長時間的表達。有人將人工的染色體顯微注射到體外成熟后體外受精的受精卵的原核中,人工染色體攜帶有LacZ基因或綠熒光蛋白基因,孵化的胚胎在封閉的STO細胞飼養層上培養。結果發現,人工染色體導入牛受精卵中,也可以使胚泡繼續發育,并且報道基因的表達一直可維持整個著床前的發育過程。同樣,在牛中,也有人將EGFP作為報道基因,與核移植技術相結合來產生轉基因的牛胚胎。將pCXNeo-EGFP構建體顯微注射到牛的體外成熟-體外受精的受精卵的原核中,大多數表達EGFP信號的胚胎都是鑲嵌型的。將表達EGFP的卵裂球進行核移植后,4.5%的由核移植卵發育來的桑葚胚在所有的卵裂球中均有很強的EGFP信號的表達。而在其他胚胎中,EGFP信號幾乎消失。當來源于EGFP陽性的核移植桑葚胚的細胞被2次培養時,所有的細胞在第2階段均表達有很強的EGFP信號,并且顯示了新霉素抗性。這些結果表明,屢次呈現非整合的EGFP的暫時性表達,并且在EGFP陽性卵裂球核移植后的EGFP陽性