牛人工授精技術的應用

1951年，世界上的第一采用了冷凍溶液的人工工藝，創造了耐寒、屠宰牛的典范。以前的想法是：。我國于1958年首次進行精液冷凍技術研究,并取得成功［２］。20世紀80年代,我國開始從國外引進先進的設備和技術用于冷凍精液的生產,到90年代時冷凍精液逐步由顆粒型轉向細管型［３］。目前利用冷凍精液人工授精技術在奶牛繁殖與改良方面應用最為普及,幾乎達到100%［４］。雖然如此,但精液冷凍-解凍后仍有大約50%的精子失去活性,嚴重降低了良種公牛的利用率。本文闡述了關于牛精液冷凍的基本原理以及冷凍保護劑的研究進展,以期為進一步提升牛冷凍精液質量提供參考。1精子的長期保存精子是一種生殖細胞,當外界環境溫度發生變化時,精子本身的活動力和代謝能力也會發生變化。將采集的新鮮精液經過品質檢查后,利用液態氮(-196℃)或固態二氧化碳(干冰-79℃)等作為冷源,將精子保存在超低溫環境下,精子的代謝活動幾乎完全受到抑制并可長期保存,也就是精子的生命在靜止狀態下長時間保存。當溫度回升解凍后,精子又能恢復原有活力,并且具有受精的能力。目前,關于細胞冷凍保存的機理尚不完全清楚,代表性的假說主要有以下五種。1.1過慢冷卻/凍結條件1972年,Mazur［５］對倉鼠組織細胞進行了低溫保存研究,并提出了細胞冷凍損傷的兩因素假說,認為造成細胞冷凍損傷的獨立因素有兩個:一是過快冷卻導致的細胞內冰晶的形成,冰晶通過破壞精子細胞膜和細胞內部結構以及滲透壓升高,從而對細胞造成損害。冷卻速度越快,所造成的損傷越大;二是過慢冷卻導致的溶質損傷/溶液損傷,這是由于細胞過長時間暴露在高濃度溶液中所致。在高濃度溶液中,細胞脫水收縮,引起細胞內原生質濃度升高,細胞器也隨之發生變化,并且在滲透收縮過程中,細胞膜壓力的增加也導致了細胞損傷。一般冷卻速度越慢時,該損傷就越大。當然,兩因素理論中的過快冷卻、過慢冷卻是相對具體細胞而言。對于冷凍保存來說,在臨界溫度范圍內的冷卻/凍結速率(5~50℃/h)相當重要,決定精子能否與細胞外環境保持平衡或隨胞內冰晶形成可能性的逐步增加變成過冷狀態。在緩慢冷卻過程中,精子會一直脫水直至達到在細胞內外的滲透平衡點,即細胞脫水會最大化。而過多地提高冷卻速率,脫水不足會導致胞內冰晶成核。然而,如果冷卻速度在所需值(50~100℃/h),即可以減少過度的細胞內脫水,降低過度的細胞內溶質濃度和減少細胞皺縮［５－６］。1.2胞內水分外滲,細胞毒性下降20世紀50年代,Lovelock等［７］研究認為,動物精子對電解質溶液的濃度具有一定的耐受范圍,而一旦超過該范圍時就會損傷精子,甚至導致精子的死亡。當環境溫度降低時,細胞間隙中的水分會形成細小冰晶,由于細胞脫水,細胞間隙液體所含的電解質的濃度相應升高,滲透壓增大,從而導致細胞內水分外滲,細胞脫水皺縮。隨著環境溫度的繼續降低,胞內剩余水分結冰,致使胞內的電解質的濃度也快速升高,當超過細胞的耐受力范圍濃度時,就會對細胞產生毒害作用,包括酶活動紊亂、細胞器受損、蛋白質變性、pH改變等,細胞最終死亡。該假說與Mazur提出的兩因素假說--過慢冷卻導致溶質損傷的理論有些近似。當對精子進行低溫保存時,在稀釋液內加入水溶性、通透性且對細胞無毒害作用的中性物質時,可以抑制冷凍過程中冰晶的形成,從而減輕冷凍保存過程對精子所造成的損害。1.3硫氫基假說的原理物理屏障假說認為,細胞內水分子會形成物理屏障保護細胞內的蛋白質免受傷害,但是冷凍會導致細胞內脫水,蛋白質由于失去水分子的保護而使其結構發生變化,細胞受到低溫損傷。1962年,研究者提出了硫氫基假說,認為由于溫度的降低導致細胞膜的物理屏障發生變化,從而引起了細胞的低溫損傷［８］。細胞的抗凍能力取決于細胞內蛋白質硫氫基(-SH)的含量,但在冷凍條件下,蛋白質會發生脫水并相互靠攏,當靠攏到一定程度時,-SH基會發生氧化作用,生成-SS-鍵或-S-S-鍵,導致膜蛋白分子構象發生改變而凝聚。解凍后,細胞內蛋白質重新吸收水分,肽鏈松散,氫鍵斷裂,但由于雙硫鍵保持不變,導致細胞蛋白質的空間構型難以復原。同時,由于細胞內聚力比膜蛋白小,在細胞結冰時產生張力,雙分子的脂類層因冷凍而較易發生破裂,最終導致細胞膜的選擇透過性發生改變,胞內物質外滲,造成細胞死亡。1.4蛋白質水合作用的機制1965年,Karrow等［９］提出結構水假說,認為細胞內的水由自由水和束縛水兩種類型所組成,束縛水是那些與蛋白質發生水合作用后包圍在蛋白質表面且不易自由流動的水分,對于維持細胞蛋白質的結構與功能具有重要作用。在細胞冷凍時,胞內的自由水首先凍結成冰,隨著冷凍的持續進行,導致胞內自由水比例降低,胞內的束縛水開始析出且凍結成冰,導致包圍在蛋白質表面的束縛水減少甚至消失,失去束縛水保護的蛋白質因析出凝聚而發生變性,造成細胞損傷甚至死亡。1.5低溫冷凍保護劑的作用機制該假說由鄭斯涌［８］提出,他認為造成細胞冷凍損傷的因素主要有兩個:(1)冷凍-解凍過程中,細胞內及細胞間的結冰與融化對細胞造成了損傷;(2)低溫冷凍時冷凍保護劑對細胞的毒害作用。在這兩個因素的作用下,導致細胞的結構和功能發生變化,尤其是對細胞膜、核膜、線粒體膜等生物膜的損害很大,導致膜蛋白發生變性,膜的通透性改變,穩定性下降;線粒體膜遭受破壞,影響能量的產生。生物膜的損傷使得細胞內物質的合成能力和酶活性顯著降低。當冷凍結束后,大量水分會滲入細胞,導致細胞內外充水,形成缺氧微環境,最終導致細胞的各種功能下降,細胞死亡。2滲流細胞外溶液冷凍保護劑根據其保護原理可分為非滲透性和滲透性兩大類。非滲透性保護劑難以滲透到精子細胞內部,但可以結合溶液中的水分子,使溶液中的自由水含量降低。同時使細胞外溶液的濃度增高,細胞內水分滲出,細胞內溶液的濃度也升高,從而減少細胞內外冰晶的形成,從而保護細胞免遭損傷的一類保護劑。如:葡萄糖、蔗糖、聚乙二醇、白蛋白等［１０］。滲透性保護劑可以滲透到細胞內部,使細胞內外溶液的濃度升高,胞內外未結冰溶液中電解質的濃度降低,保護精子細胞避免高濃度電解質的損害。另外,細胞內的水分也不過渡向外滲出,從而避免細胞因過分脫水而皺縮。例如甘油、二甲基亞砜、甲醇、酰胺類、乙二醇等［１０］。2.1快速滲透率保護劑二甲基亞砜(DMSO)和甘油是目前比較常用的抗凍保護劑,但多數報道認為甘油的保護效果更好,所以甘油的應用更為廣泛［１１］。甘油是一個擁有多個羥基、氫鍵具有結合水的能力的滲透性保護劑,能夠滲透生物膜。在精子冷凍保存過程中,甘油發生作用是通過替代細胞內的水分來維持細胞體積、離子間的交互作用和降低水的冰點,以及隨后的降低電解質濃度［１２－１３］。DMSO是一種快速滲透性的冷凍保護劑,比甘油的分子量低,但滲透性比甘油要高,且DMSO可以抑制羥基自由基的不良影響。但是,DMSO本身具有一定的毒性,有時會對細胞產生致死效應,這種效應大部分歸因于它的毒性而非滲透性。2.2精子的添加量精液病菌的感染與疾病的傳播可能由動物類冷凍保護劑引起,因而科學家近年來一直在不斷尋找新的冷凍保護劑,以提高其保護效果并減少疾病的傳播。Woelders等［６］報道,海藻糖和蔗糖均可在冷凍環境下保護精子免受傷害,但蔗糖的保護效果更明顯;王鋒等［１４］通過在稀釋液中添加乙二醇或丙二醇,使精子的頂體完整率得到顯著提高,但精子活力與存活時間無明顯變化;Bilodeau等［１５］研究表明,在EYTG中添加各種硫醇,可以有效抑制EYTG對精子的毒害作用;張文舉等［１６］報道,還原型谷胱甘肽可以顯著提高精子活力和頂體完整率,改善母牛情期受胎率;Hu等［１７］研究表明,稀釋液中添加維生素E可以降低脂質的過氧化作用,提高冷凍-解凍后的牛精液品質;Fabbrocini等［１８］及Bilodeau等［１９］報道,在精液稀釋液中加入丙酮酸鹽可以提高抗氧化性能,改善地中海水牛精子的凍后質量。Bucak等［２０］研究認為,抗氧化劑(蛋氨酸、肌醇和肉堿)可以保護精子DNA免受冷凍傷害,維持其完整性;Verberckmoes等［２１］認為,附睪液對于提高精子活力有很大幫助。Tuncer等［２２］研究認為,半胱氨酸和谷胱甘肽也能夠降低冷凍對DNA的損害;An-sari等［２３］在稀釋液中添加丁羥甲苯,發現能夠顯著提高牛精子的凍后質量;Hu等［２４－２５］研究發現,稀釋液中添加維生素B１２可顯著提高牛精子活力、頂體完整率和質膜完整率。另外,稀釋液中添加維生素還可有效減少由冷凍-解凍造成的氧化應激,維持精子的運動能力［２６－２７］。3ldl的有害成分低密度脂蛋白(LDL)和磷脂是卵黃中對精子起保護作用的主要有效成分。卵黃中的固體物質由LDL和其它物質組成,其中,低密度脂蛋白大約占2/3。LDL是一種甘油三酸脂和膽固醇內核被磷脂和蛋白外膜包圍的球狀分子,包含83%~89%的脂質和11%~17%的蛋白質［２８］。Lamia等［２９］研究證明,用LDL完全替代蛋黃后,提高了牛精子凍后活力。但是,卵黃中存在一些有害成分,這些成分不利于LDL在超低溫下對牛精子的冷凍保護。卵黃中的小顆粒物質對精子凍后活率產生一定的有害作用［３０］,卵黃中的高密度脂蛋白可誘導精子膜上的膽固醇外流,導致精子提前獲能［３１］。關于LDL保護精子的原理,Bergeron等［３２］認為,LDL與精清蛋白質結合后可以減少脂質含量,還可防止精子質膜的內部損傷;LDL中的脂質能夠與精子膜結合,防止細胞膜的完整性受到破壞,從而達到保護精