第二十一章基因診療與基因治療GeneDiagnosisandGeneTherapy一、授課章節及重要內容：第二十一章基因診療與基因治療二、授課對象：臨床醫學、防止、法醫（五年制）、臨床醫學（七年制）三、授課學時本章教學共1學時。講授安排以下：基因診療0.5學時，基因治療0.5學時。四、教學目的與規定通過本章學習，從整體上理解基因診療和基因治療的基本概念、基本理論。理解內源基因變異和外源基因入侵是造成人類致病的兩大類因素。理解基因診療和基因治療慣用技術辦法的類型和基本知識，理解基因治療的基本程序。五、重點與難點重點：掌握基因診療、基因治療的概念和理論。難點：①限制性內切酶酶譜分析法原理。②DNA限制性片段長度多態性及其用于基因診療的原理。③PCR/單鏈構象多態性分析。④基因滅活的幾個辦法。⑤基因治療的載體。六、教學辦法及授課大致安排教學辦法：重要是自學形式，講授基因診療與基因治療的概念。授課大致安排：前言3分鐘，基因診療概念2分鐘，診療辦法15分鐘；基因治療概念2分鐘，辦法15分鐘，基因治療的基本程序8分鐘。七、重要外文專業詞匯genediagnosis,genetherapy,RFLP,SSCP,genechip,RNAi,triplexapproach八、思考題1.什么是基因診療？介紹基因診療的慣用技術辦法。2.簡樸介紹基因診療的應用。3.什么是基因治療？簡述基因治療的辦法。4.基因滅活的重要辦法有哪些？簡述滅活的原理。5.簡述基因治療的基本程序。九、教材與教具:人民衛生出版社《生物化學》第六版十、授課提綱(或基本內容)概述Introduction基因診療與基因治療是分子生物學理論和技術應用到臨床醫學所產生的新的診療和治療疾病的辦法。這些新辦法是現有診療和治療疾病手段的補充和擴展。隨著分子生物學理論和技術的新進展不停應用于臨床醫學研究，人們對疾病發生、發展的分子機理的認識也不停進一步；從基因水平診療疾病和治療疾病已成為當代基礎醫學和臨床醫學研究的重要內容。隨著科學研究的不停發展，基因診療和基因治療將會為人類健康帶來更大的福音，為人類根治疑難絕癥帶來但愿和曙光。下面分基因診療和基因治療兩個方面給大家介紹這一章的內容。第一節基因診斷SectionIGeneDiagnosis{基因診療}是指運用分子生物學技術和辦法直接檢測基因構造及其體現水平與否正常，從而對疾病作出診療的辦法。從基因水平而言，造成人類致病的因素有兩大類：①機體本身基因（即內源基因）的變異，涉及基因構造突變和基因體現異常。②病原體基因（即外源基因）的入侵。在分子生物學技術建立之前，我們無法直接鑒定基因的缺點，只能通過缺點基因所造成的表型癥狀或根據缺點基因引發的多個生化指標或其它輔助檢查指標的變化對疾病作出診療。隨著分子生物學技術的發展，現在我們能夠采用分子生物學技術直接檢測和鑒定與否有內源缺點基因或外源基因的存在，使疾病的診療在傳統的表型診療基礎上增加了基因診療的內容，從而使許多疾病的診療更快速、更精確。基因診療與傳統診療學辦法的不同之處在于它是直接以基因作為探核對象。因而，它含有與其它診療學辦法完全不同的特點：①針對性強：由于基因診療是直接以基由于檢測對象，對病因診療的針對性強。②特異性強：基因診療采用的分子生物學技術（核酸分子雜交、PCR等）都能精確地分析特定基因中的特定序列的構造、或特定基因的體現水平，因而含有很強的特異性。③敏捷度高：以往的診療需要滿足一定量的樣品，對微量樣品根本無法進行操作或不敏感，無法作出診療。而分子雜交和PCR技術都能運用極少量的樣品獲得精確的成果，特別合用于疾病的早期診療。④合用范疇廣：基因診療即可檢測出內源性基因與否異常，也可檢測出人體內與否有外源性基因的存在，因此，能夠用于許多疾病的診療，在臨床上合用范疇廣。一、基因診療慣用技術辦法：基因診療慣用技術辦法涉及兩大類：一是DNA診療技術；二是RNA診療技術。DNA診療技術涉及：核酸分子雜交技術、PCR技術和DNA序列測定等；RNA診療技術涉及：RNA點雜交、Northern分析、定量PCR、mRNA差別顯示PCR等技術。在這一節只介紹DNA診療技術中幾個慣用的辦法。1．核酸分子雜交技術核酸分子雜交技術是基因診療中的基本技術之一。它的基本原理是：單鏈核酸（DNA或RNA）能夠在一定條件下與互補的單鏈核酸（DNA或RNA）結合形成雙鏈。雜交能夠在DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA以及DNA-寡核苷酸之間進行。因此，采用一段已知的核酸序列作為探針，能夠探測未知樣品中對應的核酸序列與否存在，如果樣品中有同源序列存在，核酸探針就能夠與同源序列中的互補序列結合形成雙鏈，從而得知特定核酸的存在與否。如用一段白血病有關基因的DNA序列制備成探針（已知），去探測被檢樣品（未知），如果被檢樣品中存在與探針序列相似的DNA序列，探針就可與之結合形成雙鏈，檢測成果可作為診療白血病的重要根據之一。運用核酸分子雜交技術能夠進行限制性內切酶酶譜分析、DNA限制性長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RLFP)分析，在雜交中運用等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide，ASO)還能夠分析特定基因中的突變位點。這里我們只介紹前兩種。（1）限制性內切酶酶譜分析法：此辦法是運用限制性內切酶和特異性DNA探針來檢測與否存在基因變異。圖22-1所示為β珠蛋白的基因。當該基因第六個密碼子發生A→T突變時，所編碼的氨基酸從谷氨酸被變化為纈氨酸，因而造成鐮狀細胞貧血癥。該突變同時也造成DNA序列中的一種MstⅡ限制性酶切位點丟失，運用這一特定可進行基因診療。將正常人和帶有突變基因個體的基因組DNA分別用MstⅡ酶消化后，但凡基因組上含有MstⅡ位點的地方都會被切斷，酶切后得到大小不等的片段。全部這些片段可通過電泳進行分離。在電泳過程中，各個片段可按大小分離開來。由于我們提取的是基因組DNA，在進行凝膠電泳時，每條帶的量是極少的，電泳后的條帶是完全看不見的。通過核酸分子雜交能夠顯示特定DNA片段。運用β珠蛋白基因的DNA探針可顯示出該基因的DNA片段。在圖21-1（見六版教材圖21-1）中所示，β珠蛋白基因有MstⅡ位點，因此該基因的DNA序列被切斷，雜交后顯示出2個DNA片段（1.15Kb和0.2Kb）。當突變使MstⅡ位點丟失后，該基因的DNA片段不能被切斷，因而在電泳及雜交后只顯示1個大的DNA片段（1.35Kb）；如果是雜合子，雜交后就會顯示3個DNA片段。因此，這種辦法不僅能夠診療出是正常人還是患者，并且還能夠診療出是純合突變還是雜合突變。圖21-1鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析（2）DNA限制性片段長度多態性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）在人類基因組中，平均約200對堿基可發生一對變異（稱為中性突變，）中性突變造成個體間核苷酸序列的差別，稱為DNA多態性。突變、重排、單個核苷酸的插入或缺失可使DNA次序發生變化。其中有些可能造成限制酶切位點的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位點數目、位置發生變化。用限制酶切割基因組時，所產生的限制性片段的數目和每個片段的長度就不同，這就是限制性片段長度多態性。在某一特定家族中，如果某一致病基因與某一特異的多態性片段（DNA多態性或限制性片段長度多態性）緊密連鎖，就能夠用這一多態性片段作為一種“遺傳標志”，來判斷家庭組員或胎兒與否為致病基因的攜帶者。用“遺傳標志”基因作為探針，進行雜交檢測就可判斷致病基因的存在與否。2.PCR/單鏈構象多態性分析(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)PCR/SSCP是一種快速檢測基因突變的辦法，其基本的原理是：單鏈DNA呈現復雜的構象，而這種立體構象重要是依靠單鏈內堿基配對等分子內互相作用維系的。相似長度的單鏈DNA因堿基序列不同，甚至只是一種堿基不同，都能夠形成不同的空間構象，在電泳時泳動的速率不同。進行該項檢測，首先是運用PCR技術看待測基因片段進行擴增，分別獲得正常對照DNA的PCR產物和待測DNA的PCR產物，然后將DNA變性成單鏈，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中形成不同的構像。在電泳過程中，長度相似而構像不同的單鏈DNA分子在凝膠中的泳動速率不同。如果待測DNA沒有發生突變，其序列與正常對照DNA一致，電泳后在凝膠中的位置就會與正常對照組DNA的每一條帶的位置完全一致。如果待測DNA中有突變，電泳后就會出現位置不同的條帶。借此分析與否有致病基因的存在。Leber遺傳性神經病患者是由于線粒體DNA第11778位堿基（G→A）突變所致。用PCR辦法獲得正常和待測線粒體DNA片段后，再作SSCP分析（圖21-2見六版教材圖21-2），可見待測DNA的電泳后條帶與正常DNA對照條帶不一致，闡明該基因存在有突變。圖21-2Leber病患者PCR/SSCP分析二、基因診療的應用現在基因診療已廣泛應用于下列疾病的診療：如遺傳疾病、腫瘤、多個感染性疾病、傳染性流行病以及用于判斷個體疾病易感性、器官移植組織配型、法醫學中個體識別、親子鑒定等。由于基因診療含有其它診療學辦法所不含有的特點，它將在遺傳病的防治、腫瘤的早期診療、暴發性感染性疾病的預測等方面將發揮越來越大的作用。第二節基因治療GeneTherapy現在已知許多人類疾病與特定的某個基因或某些基因有關，經常涉及到人體內基因的變異或基因體現的異常以及外源基因的入侵。因此，從基因水平消除病因將成為將來醫學的一種重要發展方向。一、基因治療的定義基因治療在早期是指用正常的基因整合入細胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療辦法。隨著分子生物學辦法和技術的不停發展和完善，基因治療的內涵已有了很大的發展。從廣義上來講，基因治療是指將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，以達成治療疾病目的的一種治療辦法。基因治療采用辦法基本上能夠分為下列幾個：1.基因矯正（genecorrection）基因矯正是指將致病基因的異常堿基進行糾正，而正常部分予以保存。2.基因置換（genereplacement）基因置換是用正常的基因通過體內基因同源重組，原位替代病變細胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常狀態。基因置換是基因治療的一種最為抱負的辦法。但由于這種辦法需要采用同源重組使對應的正常基因定位導入受體細胞的基因缺點部位。而定位導入的自然發生率約為1/100萬，因此，由于技術因素，這種治療辦法現在還難以實施。3.基因增補（geneaugmentation）基因增補是基因治療中較慣用的一種辦法。它是指將目的基因導入病變細胞或其它細胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的定點或非定點整合，使其體現產物賠償缺點基因的功效或使原有的功效得以加強。基因增補實際是在原有細胞中又增加了一種基因的拷貝，即使異常基因還存在于細胞內，但該基因編碼的產物是無毒性作用的，只是編碼產物的量局限性、或失去功效而造成疾病。因此，導入一種正常的基因使其體現產物賠償缺點基因的功效或使原有的功效得以加強，達成治療疾病的目的。4.基因失活（geneinactivation）基因失活是采用特定的方式克制某個基因的體現，或者通過破壞某個基因而使之不能體現，以達成治療疾病的目的。與基因增補不同，基因失活是由于基因編碼的產物是有毒的，即使體現得量極少也會致病，如癌基因、病毒癌基因等，這些基因編碼的產物都是有致病作用的。因此必須采用特定的方式克制或破壞這些基因的體現，使基因失活，以達成治療多個癌癥和病毒性感染性疾病的目的。①反義RNA技術：是指與mRNA互補，且能克制與疾病發生直接有關的基因體現的RNA。②核酶技術（ribozyme)：通過核酶分子結合到靶RNA分子中適宜的部位，形成錘頭構造，催化RNA分子的剪切，從而破壞靶RNA分子達成治療疾病的目的。③三鏈技術(triplexapproach):脫氧寡核苷酸能與雙鏈DNA專一性序列結合，形成三鏈DNA，從而在轉錄水平或復制水平制止基因轉錄或復制。④干擾RNA技術（interenceRNA，RNAi）：指在特定因子的作用下，由導入胞內的雙鏈RNA降解成的約22nt左右的SiRNAs。后肢運用堿基互補配對原則核靶DNA結合，同時誘導激活體內的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。同時還可運用體內轉錄系統轉錄生成第二代SiRNAs，從而長久發揮效應。二、基因治療的基本程序基因治療的基本程序涉及有下列幾個方面：（一）治療性基因的選擇基因治療中，必須針對某一具體的疾病，來選擇目的基因。如單基因缺點的遺傳病可選用對應的野生型基因作為目的基因。血管栓塞性疾病可選用血管內皮生長因子（VEGF）基因作為目的基因。在多個癌癥和病毒感染性疾病治療中，可針對特定的靶基因選用特異的反義RNA、核酶等的編碼DNA作為治療基因。選擇特定的目的基因作為治療基因是基因治療中一種重要的問題。（二）基因載體的選擇選擇好目的基因后，還必須選擇適宜的載體。目的基因只有重組到適宜的載體、形成重組DNA分子，才干導入到受體細胞中。用于基因治療的載體有兩大類：一是病毒載體，二是非病毒載體。非病毒載體轉染效率很低，而病毒含有繁殖快，感染力強的生物學特點，因而用于基因治療的載體普通多選用經改造后的病毒載體。慣用的病毒載體有3種：逆轉錄病毒（retrovirus,RV）載體、腺病毒（adenovirus,AV）載體、腺有關病毒（adenoassociatedvirus,AAV）載體。3種病毒載體各有優缺點。表22-1（見五版教材表22-1）列出了它們各自的特點。3種病毒載體中使用較多的是逆轉錄病毒載體。該載體用于基因治療含有轉移基因效率高和穩定體現的特點。但是，它只能感染處在增殖狀態的細胞，使用范疇較局限。另外，逆轉錄病毒載體在靶細胞基因組的整合是隨機的，有可能會激活原癌基因，其安全性仍然是一種值得擔憂的問題。但由于病毒載體介導基因轉移的效率較高，且迄今為止尚未出現明顯的問題，現階段用于基因治療的載體仍多采用病毒載體，隨著科學研究的不停進一步，相信會有更抱負的載體來替代病毒載體用于基因治療。表22-1幾個慣用病毒載體的特點比較（三）靶細胞的選擇目的基因與載體構建成重組的DNA分子后，需要導入適宜的靶細胞才干發揮治療作用。對不同的疾病，需要選擇不同的靶細胞。普通而言，可供選擇的靶細胞有兩大類：一類是生殖細胞，一類是體細胞。對人類基因治療研究而言，為了避免給人類造成可能的傷害，國際上嚴禁進行生殖細胞的基因治療操作。在現在條件下，基因治療僅限于體細胞。由于即使發生基因型的變化也只限于某一類體細胞，其影響也只限于某個體的當代。已被用于基因治療的靶細胞有淋巴細胞、造血細胞、上皮細胞、角質細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肝細胞、肌細胞和腫瘤細胞等。（四）基因轉移通過上述環節，構建好了重組DNA分子，也選擇好了靶細胞。下一種核心環節將治療性基因導入靶細胞。現在慣用的基因載體有兩大類，因而基因轉移辦法亦對應有兩大類。非病毒載體重要通過非生物學辦法導入靶細胞，這類基因轉移辦法涉及物理、化學、以及受體介導的辦法；但這些辦法轉移基因的效率較低。病毒載體重要通過生物學辦法導入靶細胞，即運用病毒蛋白將載體包裝成假病毒顆粒，通過病毒感染機制將基因載體導入靶細胞。病毒載體的轉染效率相對較高，因而在基因治療的臨床實施中多采用病毒介導的基因轉移技術將外源基因導入靶細胞中。然而在實際應用中，即使是采用病毒載體也不能有效地進行體內基因轉移。由于眾多因素的影響，現在在體內很難實現靶向、高效地轉移治療性基因體現載體。這個問題是制約基因治療技術發展的瓶頸問題。（五）外源基因體現的篩檢由于體內轉染困難，在基因治療研究中，大多數狀況下是將基因導入體外培養的細胞。無論采用上述哪種辦法將外源基因轉移到體外培養的靶細胞中，轉移后的產物實際是混合物。在混合物中有的細胞含有特異的外源基因，這類細胞稱為轉化細胞。有的細胞不含外源基因，這類細胞稱為非轉化細胞。基因治療中需要的是含有特異外源基因的轉化細胞。因此，必須篩選出轉化細胞。篩選是運用載體分子上攜帶特定抗性基因進行的。在大多數哺乳動物細胞體現載體上都帶有新霉素抗性基因(neor),該基因編碼的產物是一