mirna-155對人乳腺癌mcf-7細胞p53inp1表達的影響

在人類基因中，約3%編碼mirna，30%編碼蛋白的基因受mirna的控制。miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程,包括調節發育、造血、器官形成、細胞的增殖、分化和凋亡,相應miRNAs的表達與包括腫瘤在內的多種疾病有關。miRNA-155定位于人染色體21q21,由B細胞整合簇(Bcellsintegrationcluster,BIC)基因第3個外顯子高度保守區域編碼,其表達水平受BIC基因的轉錄水平和miRNA加工等調控。BIC是一種在活化的B淋巴細胞、T淋巴細胞及單核/巨噬細胞內高表達的非編碼轉錄產物,其不含開放讀碼框,過表達BIC基因可促進細胞異常增殖。miRNA-155在多種人體腫瘤中異常表達,與腫瘤的發生發展及預后密切相關,被認為是癌性微小RNA(oncomiR),其在一系列實體腫瘤中呈過度表達。最近研究發現,miRNA-155與乳腺癌密切相關,Zhu等發現,miRNA-155在乳腺癌中隨著腫瘤臨床病理分期(Tumornodemetastasis,TNM)的增高,表達水平呈上升趨勢;在淋巴結轉移組中的表達高于無淋巴結轉移組;同時發現在低增殖指數組的表達明顯低于高增殖指數組。此外,miRNA-155在雌激素受體(Estrogenreceptor,ER)及孕激素受體(Pro-gesteronereceptor,PR)陽性乳腺癌患者中的表達明顯高于陰性患者,提示miRNA-155與乳腺癌內分泌受體間存在相關性,其作用機制尚在研究中。本實驗將miRNA-155mimics轉染至ER陽性的人乳腺癌MCF-7細胞,使細胞過表達miRNA-155,研究其與細胞增殖凋亡調控蛋白TP53INP1表達的關系,及相關蛋白Caspase-3、p21的表達變化,探討miRNA-155對乳腺癌細胞增殖凋亡的影響,及其作用機制,期望能為乳腺癌的治療提供新的靶點。1材料和方法1.1細胞1.2主試劑1.5mirna-14基因的pcr擴增采用RealtimeRT-PCR法。提取各組細胞的總miRNA,逆轉錄合成cDNA第一鏈,以其為模板,PCR擴增miRNA-155基因,以U6作為內參。引物序列見表1。記錄各反應管中的熒光信號達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值,采用定量PCR的相對定量法,以2-ΔΔCt法來計算各組細胞中目的基因的表達。1.6cck-8試驗采用CCK-8法。各組細胞轉染12h后,經0.25%胰酶消化,按4×103個/孔,將200μl細胞懸液加入96孔板內(邊緣加無菌PBS),每組設4個復孔,置37℃,5%CO2飽和濕度孵箱內,分別培養24、48、72h。取出96孔板,按10μl/孔加入CCK-8,繼續培養0.5~4h,酶標儀檢測A450值,并按下式計算增殖率。試驗重復3次。增殖率(%)=[(A轉染組-A陰性對照組)/A陰性對照組]×100%1.7流式細胞術檢測細胞凋亡和周期采用流式細胞術。各組細胞經0.25%胰酶消化后,2000×g離心10min,棄上清,用冷PBS洗滌2次,再用少量PBS將細胞重懸,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率;70%預冷乙醇4℃固定過夜,上流式細胞儀檢測細胞周期。試驗重復3次。1.8tp33inp1、羊抗鼠、igg、hrp1的添加量采用Westernblot法。取轉染48h的各組細胞,加入裂解液,提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,經SDS分離后,電轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉37℃封閉2h;分別加入兔抗人TP53INP1多抗(1:100稀釋)、兔抗人Caspase-3單抗(1:1000稀釋)、兔抗人Caspase-3激活型單抗(1:300稀釋)、鼠抗人p21單抗(1:500稀釋),4℃孵育過夜;TBST洗膜3次,分別加入HRP標記的羊抗兔IgG(1:5000稀釋)和羊抗鼠IgG(1:5000稀釋),37℃孵育2h;TBST洗膜3次,ECL發光顯影,經QuantityOne軟件分析圖片,以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示相對蛋白含量。1.9統計學處理應用SPSS17.0軟件進行統計學分析,實驗數據以均數±標準差(ue0af±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1fam-ncfam-nc激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示,細胞中帶有綠色熒光小點即為FAM-NC。計數50個細胞內的平均綠色熒光點數,80%的細胞熒光點多于5個,見圖1。2.2各組細胞中mirna-155基因的轉移水平2.4細胞增殖p值流式細胞術檢測結果顯示,轉染組G1期比例明顯低于空白對照組和陰性對照組,差異有統計學意義(P值分別為0.037和0.009),提示轉染后處于S期和G2期的細胞增多,即處于分裂狀態的細胞增多;轉染組細胞凋亡率明顯低于空白對照組和陰性對照組,差異有統計學意義(P值分別為0.005和0.008),見表3和圖3、圖4。2.5tp33inp1、p2p1及caspase-3激活型蛋白表達量Westernblot檢測結果顯示,與空白對照組和陰性對照組相比,轉染組TP53INP1、p21及Caspase-3激活型蛋白表達量明顯減少,差異均有統計學意義(P值分別為0.002,0.003、0.004,0.004、0.002和0.005),見表4和圖5。3mirna-十五分子中tp33inp1的表達miRNA是一類近年發現的短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子RNA,長約19~25個核苷酸。其通過與靶mRNA的3′端非編碼區(3′UTR)堿基配對的方式來執行抑制功能,完全互補配對可能對靶mRNA進行降解,而不完全互補配對僅抑制靶mRNA的翻譯過程,對基因進行轉錄后表達的調控。研究發現,部分miRNAs通過調節原癌基因或以癌基因及抑癌基因的形式參與腫瘤的形成。Iorio等應用微陣列分析了76份乳腺癌組織和10份正常組織,發現29條miRNA表達失調,其中miRNA-155表達明顯上調,表明miRNA-155扮演了類似癌基因的調控角色。在眾多靶基因中,TP53INP1引起了我們的注意,TP53INP1是細胞周期檢測點p53的靶基因,其在細胞周期停滯和p53介導的凋亡中發揮重要作用。TP53INP1過表達誘導G1細胞周期停滯,促進細胞凋亡,發揮抑癌基因的作用。本研究成功將miRNA-155mimics轉染MCF-7細胞,使miRNA-155表達上調,TP53INP1的表達下降,細胞增殖活性增加,凋亡率下降,細胞阻滯在S期和G2期,表明miRNA-155可能以TP53INP1為靶基因促進乳腺癌的發生發展。Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族,在細胞凋亡過程中起關鍵作用。Caspase-3處于細胞凋亡的下游,是Caspase家族中關鍵效應酶,是凋亡執行的重要效應分子,廣泛表達于多種腫瘤組織中。正常情況下,胞質內Caspase-3以無活性的酶原形式存在,凋亡程序一旦開始,Caspase-3酶原被切割活化,使Caspase-3酶原形式減少,活化形式增加;反之若抑制細胞凋亡,Caspase-3酶原被切割活化減少,酶原形式增多。活化的Caspase-3引起多重效應,使與胞質、胞核及細胞骨架有關的重要蛋白質降解失活,引起細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的重要通路。p21基因是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子,其與p53共同構成細胞周期G1檢查站,導致細胞周期停滯。本研究顯示,轉染miRNA-155mimics后,p21蛋白表達減少,Caspase-3活性水平降低。由此可見,TP53INP1可能通過p21調控細胞周期,以及經活化Caspase-3途徑引起細胞凋亡。綜上所述,miRNA-155抑制TP53INP1表達是促進人乳腺癌MCF-7細胞增殖的關鍵環節,miRNA-155作為乳腺癌治療的新靶點具有重要價值。乳腺癌MCF-7細胞由重慶醫科大學病理生理學教研室提供。新生牛血清、DMEM干粉培養基及Opti-MEMIReducedSerumMedium購自美國GIBCO公司;hsa-miRNA-155mimics及陰性對照(無關序列,熒光標記FAM-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司[hsa-miRNA-155mimics:5′-UUAAUGCUAAUCGUG-AUAGGGGUCCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3′,陰性對照(FAM-NC):sense:5′-UUCUCCGAACGUGU-CACGUTT-3′;anti-sense:5′-ACGUGACACGUUCGGA-GAATT-3′];脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;miRNA快速提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京百泰克生物技術有限公司;兔抗人TP53INP1多克隆抗體購自美國SantaCruz公司;兔抗人Caspase-3單克隆抗體購自美國Epitomics公司;鼠抗人p21單克隆抗體、ECL發光試劑盒/SDS凝膠試劑盒及CCK-8均購自上海碧云天生物技術研究所;兔抗人Caspase-3激活型單克隆抗體購自美國Anbo公司;HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG均購自北京四正柏生物技術有限公司。1.3復蘇細胞的培養用含10%新生牛血清、1×105U/L青霉素、100㎎/L鏈霉素的高糖DMEM培養液,于37℃,5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養復蘇的MCF-7細胞。取對數生長期的MCF-7細胞用于實驗。1.4實時熒光定量pcr檢測mirna-5細胞轉染按照Invitrogen公司及上海吉瑪公司提供的操作手冊進行瞬時轉染。于轉染前1d,將細胞按2×105個/孔接種至6孔板,每孔加2ml不含抗生素的DMEM培養基,設空白對照組(不作任何處理)、陰性對照組(轉染FAM-NC)和轉染組(轉染miRNA-155mimics)。待細胞生長至30%~50%融合時,將5μl/孔LipofectamineTM2000,用250μlOpti-MEMI稀釋,輕混后室溫孵育5min;5μl/孔miRNA-155mimics(或FAM-NC),用250μlOpti-MEMI稀釋,將二者輕輕混合,室溫靜置20min,以形成mimics(或FAM-NC)-轉染試劑混合物。將混合物加至含細胞及培養液(約1.5ml)的孔中,于37℃,5%CO2培養箱溫育24~48h。激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達,并檢測轉染效率。RealtimeRT-PCR結果顯示,轉染組的miRNA-155基因的轉錄水平明顯高于空白對照組和陰性對照組。以2-ΔΔCt法計算miRNA-155的表達量,空白對照組為(1.02±0.26),陰性對照組為(1.32±0.15),轉染組為