T/FQIA018—2023茶青中草銨膦、草甘膦殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了茶青中草銨膦、草甘膦以及氨甲基膦酸殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于茶青中草銨膦、草甘膦以及氨甲基膦酸殘留量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T2102-2011茶葉抽樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理[9-Fluorenylmethylchloro-formatd(FMOC-CL)]衍生化反應(yīng)后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1試劑5.1.1乙腈（CH3CN，CAS號(hào)：75-05-8）：色譜純。5.1.2丙酮（CH3COCH3，CAS號(hào)：67-64-1）。5.1.3甲酸（HCOOH，CAS號(hào)：64-18-6）：色譜純。5.1.4乙酸銨（CH3COONH4，CAS號(hào)：631-61-8）：色譜純。5.1.5甲醇(CH3OH，CAS號(hào)：67-56-1)：色譜純。5.1.6鹽酸(HCl)。5.1.7氫氧化鉀(KOH)。5.1.8硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。5.1.9氯甲酸-9-芴基甲酯（C15H11ClO2，CAS號(hào)：28920-43-6）：純度99%，0℃~4℃保存5.1.10除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。5.2溶液配制5.2.15%硼酸鈉溶液：稱取5g硼酸鈉，溶解于100mL水中搖勻即得。5.2.23mol/L鹽酸溶液、0.3mol/L鹽酸溶液:量取270mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL，此溶液濃度為3mol/L；再用水稀釋10倍即為0.3mol/L。5.2.3氫氧化鉀溶液（20%）：稱取20g氫氧化鉀溶于適量水，并用水稀釋定容至100mL。5.2.4酸度調(diào)節(jié)劑：稱取16g磷酸二氫鉀溶于160mL水中，加入13.4mL鹽酸和40mL甲醇，混T/FQIA018—20235.2.5FMOC-CL衍生化試劑（1.0g/L）：稱取0.10gFMOC-CL，用丙酮溶解并定容至100mL。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1草甘膦（PMG）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Glyphosate，CAS號(hào)：1071-83-6，分子式：C3H8NO5P）。5.3.2草銨膦（AMG）標(biāo)準(zhǔn)品（GlufosinateammoniumCAS號(hào)：77182-82-2，分子式：C5H15N2O4P純度≥98%。5.3.3氨甲基膦酸（AMPA）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Aminomethylphosphonicacid，CAS號(hào)：1066-51-9，分子式：CH6NO3P）：純度不低于98.0%）。5.3.4草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)：草甘膦-C13N15，純度為100mg/L水溶液。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L）：分別準(zhǔn)確稱取0.0125g（精確到0.1mg）草銨膦、草甘膦以及氨甲基膦酸于25mL容量瓶，分別加入適量水以及2滴鹽酸。充分搖勻確保其全部溶劑，加水定容至刻度，裝于塑料瓶中，置于0℃~4℃冰箱避光保存，有效期1年。5.4.2同位素內(nèi)標(biāo)工作液（2.0mg/L用水稀釋成2.0mg/L，置于0℃~4℃冰箱避光保存，有效期為6個(gè)月。5.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：據(jù)每種儲(chǔ)備液的濃度，移取一定量的單個(gè)儲(chǔ)備液于25mL容量瓶中，用水定容至刻度。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液避光0℃~4℃保存，保存期為一個(gè)月。5.5材料5.5.1固相萃取小柱：C18與GCB雙層固相萃取小柱（6mL，500mg）或相當(dāng)者。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（ESI）。6.2分析天平：感量0.1mg和感量0.01g。6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。6.4高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.5容量瓶：10mL到100mL。6.6渦旋混合器。6.7帶螺蓋的離心試管：50mL和15mL。6.8氮吹儀。7試樣的制備與保存按NY/T2102-2011抽取茶青樣品，將樣品粉碎，混勻，密封，作為試樣；在抽樣和制樣的操作過(guò)程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化；將試樣于-18℃及以下冷凍保存。8分析步驟8.1前處理8.1.1提取稱取約2g（精確至0.01g）均勻試樣，置于50mL塑料離心管中，加入200μL同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.4.2），加入20mL水，渦旋振蕩5min，超聲提取30min，以5000r/min離心10min，取上清液，待凈化。8.1.2凈化分別用3mL甲醇和3mL水預(yù)淋洗固相萃取柱，棄去流出液。將5mL待凈化的上清液加入活化后的固相萃取柱中，依自然重力過(guò)柱，收集中間部分洗脫液2mL，待衍生化。T/FQIA018—20238.1.3衍生化取0.40mL收集液（8.1.2）于15mL離心管中加入0.40mL5%四硼酸鈉溶液，混勻，再加入0.5mL1g/L衍生化試劑（5.2.5），渦旋混勻，室溫靜置衍生化反應(yīng)2h后，于4℃~8℃冰箱中放置過(guò)夜。取衍生后的樣液放置至室溫，以4000r/min離心2min，上清液過(guò)0.22μm孔徑濾膜，供液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)試。另取0.40mL標(biāo)準(zhǔn)工作液體（5.4.2），與試液同步進(jìn)行衍生。8.2測(cè)定8.2.1液相色譜參考條件a)色譜柱：Shim-packGISS-HPC183μm，2.1×150mm或者相當(dāng)者；b)流動(dòng)相：A為5mmol/L乙酸銨+0.2%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；c)流速：0.30mL/min；d)柱溫：室溫；表1流動(dòng)相及其梯度條件流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%0123458.2.2質(zhì)譜參考條件a)離子源類型：電噴霧離子源ESI；b)掃描方式：正離子掃描；c)霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饣蚱渌线m氣體；使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求；d)氣簾氣壓力（CUR）：35；e)霧化器壓力(GS1)：55Psi（氮?dú)猓籪)加熱輔助氣(GS2)：55Psi（氮?dú)猓籫)霧化溫度：450℃;h)離子源噴霧電壓IS：4500i)草銨膦、草甘膦、氨甲基膦酸:離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量參見附錄B。j)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)：每種農(nóng)藥分別選擇一對(duì)定量離子、一對(duì)定性離子。每組所有需要檢測(cè)離子對(duì)按照出峰順序，分時(shí)段分別檢測(cè)。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)，參見附錄B。8.2.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線選擇與被測(cè)樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品8.1部分進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.025mg/L、0.050mg/L、0.10mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)儀器性能和檢測(cè)需要選擇不少于5個(gè)濃度點(diǎn)，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。以農(nóng)藥定量離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。8.2.4定性及定量8.2.4.1保留時(shí)間被測(cè)試樣中目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，相對(duì)誤差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。T/FQIA018—20238.2.4.2離子豐度比在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜定量和定性離子均出現(xiàn)，而且同一檢測(cè)批次，對(duì)同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的定性離子和定量離子的相對(duì)豐度比與質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在目標(biāo)農(nóng)藥。表2定性時(shí)離子豐度比的最大允許偏差>50%>20%～50%>10%～20%±20%±25%±30%本方法的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)LC-MS/MS圖參見附錄C。8.2.4.3定量?jī)?nèi)標(biāo)法定量。8.3試樣溶液的測(cè)定將基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液依次注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，保留時(shí)間和定性離子定性，測(cè)得定量離子峰面積，待測(cè)樣液中農(nóng)藥的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的定量測(cè)定線性范圍之內(nèi)，超過(guò)線性范圍時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)定濃度進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再進(jìn)行分析。8.4平行試驗(yàn)按8.1～8.3的規(guī)定對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。8.5空白試驗(yàn)除不加試樣外，按8.1～8.3的規(guī)定進(jìn)行平行操作。9結(jié)果計(jì)算和表述試樣中各農(nóng)藥殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，單位為毫克每千克（mg/kg），按式（1）計(jì)算。 式中：X——樣品中除草劑農(nóng)藥殘留量，單位為微克每千克（mg/kg）；C——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中除草劑的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；Ci——樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；A——樣液中利除草劑農(nóng)藥的峰面積；Asi——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V——樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；Csi——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mLAi——樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中利巴韋林的峰面積；m——最終樣液代表的試樣質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留2位有效數(shù)字。當(dāng)結(jié)果大于1mg/kg時(shí)，保留3位有效數(shù)字。10靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度10.1靈敏度本方法各項(xiàng)目定量限為0.05mg/kg。T/FQIA018—202310.2準(zhǔn)確度本方法在0.050mg/kg~0.500mg/kg添加濃度的回收率為60%~120%。10.3精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。T/FQIA018—2023（資料性）草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸衍生物的英文中文名稱對(duì)照索引草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸衍生物的英文中文名稱對(duì)照索引見表A.1。表A.1草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸衍生物的英文中文名稱對(duì)照索引表1C3H8NO5P2C5H18N3O4PT/FQIA018—2023（資料性）草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸衍生物的保留時(shí)間、母離子、子離子及離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸衍生物的保留時(shí)間、母離子、子