第四章分子生物學研究法10/25/20231本章內容掌握：細菌轉化；DNA序列測定；基因敲除；RNA干擾；酵母雙雜交；cDNA文庫了解：其他相關分子技術10/25/202321DNA相關技術

1.1細菌轉化定義：一個細菌細胞攝入并表達外源DNA的過程(書上：指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的？DNA而導致性狀特征發生遺傳改變的生命過程)（1）CaCl2法轉化過程中的受體細菌應是限制修飾系統缺陷型菌株并且0℃低滲CaCl2處理成感受態。通過短暫的熱刺激（42℃）可以使細菌攝入外源DNA（2）電擊法（電脈沖導致細胞膜凹陷隨著跨膜電壓的增加造成疏水性孔洞變為親水性孔洞）10/25/20233*外源基因在細菌中的表達目的基因體外擴增（PCR若是真核需從CDNA文庫擴增或cDNA為模板擴增）（見問題）與載體連接（酶切）（雙酶切，單酶切）（表達載體/克隆載體、多克隆位點-包含多個(最多20個)限制性酶切位點(restrictionsite)的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭(polylinker),是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列）轉化篩選（質粒抗性標記，藍白斑*，（菌落PCR）誘導表達10/25/20234

藍白斑篩選的原理:載體含lacZ的調控序列和N端。宿主細胞可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的。（lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補）。由α-互補而產生的lacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。10/25/20235計算插入頻率:白色菌落數/(白+藍)菌落數轉化頻率：每ugDNA轉化菌落數10/25/202361.2基因文庫（cDNA文庫）的建立genebank（library）：一個含有基因組各個DNA片段的克隆的集合。cDNA：以mRNA為模板在逆轉錄酶作用下形成的DNA。cDNA有組織特異性（都是該組織細胞現在表達的基因）cDNA文庫：以mRNA為基礎在逆轉錄酶作用下，逆轉錄出DNA克隆形成的集合10/25/2023710/25/20238cDNA文庫的建立1.高質量的mRNA的制備利用3’polyA尾巴，將用生物素標記的寡聚（dT）引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚（dT）引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA10/25/20239②mRNA體外合成DNA(反轉錄)使用無Rnase活性的反轉錄酶（防止降解mRNA）在反轉錄系統中加人寡聚（dT）及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA應選用活性較高的反轉錄酶及甲基化dCTP，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性（第一條鏈甲基化，兩端不同的酶切位點以保證第一條鏈與另一條鏈區別開。編碼表達蛋白的是哪條鏈?）10/25/20231010/25/20231110/25/202312③克隆在組織和培養的細胞中，各種mRNA的含量是極不相同的，根據mRNA分子含量的多寡（豐度）可以將mRNA劃分為高豐度、中豐度和低豐度3種不同的類型10/25/202313克隆數量與涵蓋概率有如下關系N=ln(1-P)/ln(1-1/n)N:克隆數P：某個基因被文庫所包含的概率（要求大于99%）1/n：每一種低豐度的mRNA占總mRNA的分數。則根據表中數據，cDNA文庫所需要的最少克隆數為cDNA文庫的構建可以保證大規模測序等基因組學研究10/25/2023141.3SNP技術SNP單核苷酸多態性分子構象由于堿基的不同在電泳或高效液相檢測中移動性不同作用解釋不同個體對藥物敏感性差異犯罪身份，親子鑒定，器官移植配對篩選10/25/20231510/25/2023161.4核酸序列分析人工法：適用于小片段DNA,需要放射性物質，安全性低酶法（Sanger），又稱合成法、末端終止法、雙脫氧法化學法（Maxam和Gilbert）自動法：適用于較大的片段序列自動分析儀**最新方法：1.來自斯坦福大學應用物理學系的研究人員在2006年8月11日的Science雜志上發表文章，介紹了一種利用單個RNA聚合酶分子運動的DNA測序新方法，受到各方的關注。2.2011年2月韓國浦項工學大學化學學科金光秀教授發明的新方法（見下頁介紹）10/25/2023171研究人員發現在轉錄中核苷酸將限制轉錄的速度，聚合酶會在稀有堿基的位置上停滯不前。利用一種能夠分辨堿基對的超穩定捕捉裝置（ultrastableopticaltrappingapparatus）監控四種核苷酸的數量受限情況下的轉錄。從轉錄暫停記錄的排列模型分析中，我們能夠確定DNA的序列。該原理的證據證明核酸酶的前進可以用來直接提取DNA序列的信息。

2韓國浦項大學化學學科金光秀教授研發出了一種高速DNA破譯方法，可以利用擁有碳原子層的石墨帶狀體閱讀30億對DNA堿基。當帶著人類基因信息的DNA通過納米大小的小孔的時候，四種DNA堿基都會接觸石墨帶狀體大約1微秒，這樣就可以觀察DNA堿基接觸石墨體后，石墨體導電性能的變化。這些信息變化就可以由一臺電腦收集，在短短一個小時之內就可以對DNA進行測序。金教授的研究成果不僅僅縮短了測序的時間，而且大大削減了DNA測序成本。

10/25/2023181.4.1末端終止法原理：DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作為模板準確合成互補鏈雙脫氧的核苷酸可以摻入寡聚核苷酸的末端，但會終止鏈的繼續延伸（？）步驟：模板分為四份，每份均加入引物，聚合酶和底物核苷酸，其中一種核苷酸進行放射標記（如動畫中放射性標記A（黃色表示）；（生化書，偶然性）；加入放射性標記的引物（M13）四份分別加入不同的雙脫氧核苷酸，給于適當的條件進行體外合成合成結果進行電泳，通過電泳條帶讀出核苷酸順序動畫10/25/2023191.4.2.化學法（直讀法）原理：利用不同化學試劑對DNA中的堿基發生作用，而后在哌啶的作用下切斷核苷酸鏈，產生大小不同的特異DNA片段DMS（硫酸二甲脂）中性作用G（DMS在中性環境中使G上N7位甲基化，后鳥嘌呤與脫氧戊糖間的糖苷鍵在中性環境下加熱斷裂，核苷酸鏈在G處斷裂）酸性（pH=2）下作用G+A肼堿性下作用于T+C加入1mol/L的鹽作用于C10/25/202320步驟：①待測序列末端放射性標記（3‘端或5’端）分四份，分別加入中性DMS，稀酸DMS，堿肼，鹽環境肼。及一定量的哌啶②電泳。③放射性自顯影。④直接讀出。10/25/202321***ACTTCGACAA1:ACTTCG2:AACTTCGACTTCGAACTTCGACAACTTCGACAA3:ACACTACTTACTTCACTTCGAC4:ACACTTCACTTCGAC10/25/2023221.4.3自動測定基本原理為雙脫氧鏈終止法采用熒光標記計算機自動讀取結果10/25/202323現在多使用不同顏色的熒光劑標記雙脫氧核苷酸，然后于一個體系內反應并一起電泳，通過顏色不同讀取順序10/25/2023241.5DNA與蛋白質相互作用的研究1.5.1凝膠滯緩實驗（已知DNA片段是否可與特定的蛋白結合）DNA與某種蛋白結合，由于相對分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，從而使遷移率變小1.5.2DNaseⅠ足跡實驗（確定結合的位點）用32P標記雙鏈DNA末端，用限制性內切酶去掉其中一個末端，得到只有一條鏈的單個末端標記的雙鏈DNA，與細胞蛋白提取物混合10/25/202325加入少量DnaseⅠ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達到平均每條DNA只發生一次磷酸二酯鍵斷裂進行凝膠電泳分離若蛋白質不與DNA結合，則將產生一系列僅相差一個核苷酸的DNA若蛋白質與DNA結合，則與蛋白質結合的部分將不產生條帶10/25/202326凝膠滯緩實驗10/25/20232710/25/2023282基因克隆技術2.1體外基因擴增PCR（聚合酶鏈式反應，PolymeraseChainReaction）技術、基因體外擴增、無細胞分子克隆10/25/202329原理：雙DNA加熱變性為單DNA變性單鏈作為模板加入DNA聚合酶、底物、引物可以合成新的互補鏈從而達到擴增的目的10/25/202330反應體系與過程①雙鏈DNA②底物、聚合酶③一對與待擴增DNA兩端互補的引物過程：預變性變性：雙DNA解成單DNA，高溫（>91℃）退火：引物同模板結合延伸：合成鏈循環前三步循環n次，可獲得2n個DNA分子*TaqDNA聚合酶是從Thermusaquaticus菌提取的熱穩定性酶Taq具有5’-3’DNA聚合酶活性和對雙鏈DNA特異的5’-3’外切核酸酶活性,從細菌體內提出后無3,-5,外切功能,DNA聚合酶中聚合酶1有此校對功能,Taq耐高溫動畫10/25/2023312.2反向PCR（reversePCR）擴增位于靶DNA區段之外的未知DNA序列*先用一種在靶DNA區段上無識別位點的限制性內切酶，切割靶DNA區段兩側的DNA分子*將切割得到的片段連接成環形。*根據已知的靶DNA序列按向外延伸的要求設計一對向外引物，保證被擴增的是位于靶DNA區段兩側的未知DNA序列*PCR即可得到靶DNA區段之外的未知DNA序列10/25/20233210/25/2023332.3RACEcDAN末端快速克隆目的:獲得全長cDNA（完整的cDNA可通過文庫篩選或通過該方法獲得，該方法比文庫節約時間）一般擴增特異基因或DNA片段需兩個特異引物。該方法需已知某一cDNA序列（P163：該序列可來自序列表達標簽，減法cDNA庫、差示顯示和基因文庫篩選）流程(P164圖)獲得RNA（組織提?。┤チ姿峄?“端磷酸基團）其他的RNA都可去，but帶帽子結構的mRNA受保護去掉帽子結構，加特異RNA寡聚接頭(其他的RNA加不上因為去磷酸基團。3’的通過ployA)以特異性寡聚dT（dT3‘端增加一個堿基如：A,T(dT),G,C就只能在特定位置啟動DNA合成）為引物，逆轉錄合成第一條cDNA，包含了寡聚接頭的互補序列分別以第一條cDNA為模板進行RACE（5’RACE-----為獲得5‘cDNA序列------以5’端寡聚接頭的部分序列和3‘基因特異引物進行PCR-----過程見下頁圖，5’；3’)；10/25/20233410/25/2023352.4CDNA差示分析法篩選特異表達基因1.因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴增。2.12/24(實驗室多用12/24堿基接頭）：每次換接頭時12堿基的前4個一樣，（與四堿基內切酶的粘性末端互補），后8個與