菠蘿蛋白酶的影響因素及影響其酶活力的因素

它是一種基酶，是從未經授權的葡萄樹植株中提取的水解酶系，主要存在于羅地亞莖和水果中。因其能分解蛋白質、肽、脂和酰胺,具有較高的生物活性,在各個生產領域中得到了廣泛的應用。在生物化工中,可用于干酪、明膠、水解蛋白的生產;在食品工業中可作為一種食品添加劑,使肉類嫩化、啤酒澄清;在醫藥工業中,可以治療水腫及多種炎癥,且適用于中小面積深度燒傷的治療。酶生物活性的高低用酶活力來表示,而酶活力的大小和穩定性則直接影響到酶在各個生產領域中的應用效果。1影響酶活性的因素1.1最適反應溫度的確定在干燥環境中,菠蘿蛋白酶活力相對穩定,隨著環境濕度增大,高水分增加了酶結構的柔性,也使蛋白酶發生自水解作用,酶失活速率加快。詳見表1。在零度以上,溫度越低越有利于菠蘿蛋白酶的長時間保存。在酶的反應過程中,該酶的最適反應溫度實際上是酶反應速度與酶變性速度綜合影響的結果。如果反應時間為10min,則最適反應溫度介于55~60℃之間。當反應時間越長,測得的最適溫度會有所降低。章佩芬等的實驗結果顯示,菠蘿蛋白酶的較佳反應pH在6.5~7.5之間,在pH=7.1附近達到最大值。1.2糖酸糖糖的保護作用50%葡萄糖可將菠蘿蛋白酶的半壽期延長10倍,具有顯著保護作用;40%半乳糖也有一定的保護作用,半壽期提高3倍,見圖1。蔗糖、麥芽糖、棉子糖和松三糖均有明顯的保護作用,見圖2。據李興等實驗結果表明,50%甘油可將菠蘿蛋白酶的半壽期延長8倍,乙二醇和甘露醇對菠蘿蛋白酶有一定的保護作用,葡聚糖和肌醇則沒有保護作用。1.3不同濃度的fe3+、fe2+、cu2+對菠蘿蛋白酶活性的影響在菠蘿蛋白酶浸提液中加入金屬離子溶液后,混合均勻,在40℃保溫40min,測溶液的酶活,不添加金屬離子浸提液做參比,實驗結果見表2。結果表明,在實驗范圍內,Fe3+、Fe2+、Cu2+對浸提液中菠蘿蛋白酶的活性具有較明顯的抑制作用,其中Fe3+的影響最大。而浸提液中的Ca2+含量在20~40mg/L時,有利于提高酶的穩定性。王曉敏等的實驗結果亦表明在37℃下,Ca2+與酶作用60min后,酶活性有所提高。其中Ca2+濃度為2mmol/L時對酶活性促進作用最明顯,比原酶活性高出約6%。在60℃下,Ca2+濃度為3mmol/L時對菠蘿蛋白酶的熱穩定性效果最好,處理100min后仍能保留68%的活性。1.4菠蘿蛋白酶的修飾酶未經修飾的聚乙二醇對菠蘿蛋白酶有抑制作用,當聚乙二醇濃度為40%時,抑制作用最明顯,酶活僅存有原酶活的85.5%。用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進行化學修飾,得到菠蘿蛋白酶的修飾酶。PEG作為一種修飾劑與菠蘿蛋白酶相連從而在菠蘿蛋白酶外形成一個保護膜,一定程度上抵抗了熱、酸堿的破壞。與天然菠蘿蛋白酶相比,經PEG修飾的酶在熱穩定性及酸堿穩定性上都有顯著提高。并且Ca2+和Mg2+對修飾酶的活力有很強的激活作用。當Ca2+的濃度達到0.05mg/mL時,修飾酶的活力高達257.66%;當Mg2+的濃度達到0.035mg/mL時,修飾酶的活力高達147.25%。1.5有機溶劑測活體系中測定各醇溶劑的剩余酶活力將果菠蘿蛋白酶分別加至不同濃度有機溶劑中處理60min,分別在含對應濃度的有機溶劑的測活體系中測定它們的剩余酶活力,結果見表3,隨著有機溶劑濃度增大,酶活力呈直線下降,當甲醇、乙醇、乙二醇濃度分別達到25.5%、20.5%和24.0%時,酶活力喪失一半;在有機溶劑濃度達到50%時,酶活力完全消失。1.6加入某些氧化酶菠蘿蛋白酶在提取分離和干燥過程中,酶的活性中心巰基易被氧化而使酶活性降低。林韶湘等研究表明,在提取過程中適當加入某些抗氧化劑,對阻止酶被氧化失活有良好作用。其中以硫代硫酸鈉和半胱氨酸的組合最為明顯。在莖酶中,半胱氨酸+硫代硫酸鈉組合使酶活性比對照組提高69.06%。在70%成熟度的全果酶中,硫代硫酸鈉+半胱氨酸組合的比對照組提高35.51%。作為菠蘿蛋白酶活性保護劑,硫代硫酸鈉與半胱氨酸組合使用,可獲較好的效果。1.7氨基酸酯類蛋白酶,包括基本酶純菠蘿蛋白酶在室溫下貯存1個月,酶活力大約下降20%~30%。HeinickeR.M.報導,添加苯甲酸鈉,貯存1個月后酶活力比對照組提高14%;添加C-半胱氨酸,貯存1個月后酶活力比對照組提高20%。據Renee報導,添加焦亞硫酸鈉,在15℃下避光保存2個月酶活力保持不變。據LiangHH報道,茶多酚與菠蘿蛋白酶的結合能使菠蘿蛋白酶在60℃下貯存的半衰期提高1倍。據潘江球等報導,Polyacrylamide(PAAM)穩定劑可使酶失活半衰期延長108d,明顯提高了酶的穩定性。2酶活性測定2.1可見分光光度法2.1.1福林試劑活性測定菠蘿蛋白酶在一定的溫度與pH條件下,水解酪蛋白底物,產生的酪氨酸在堿性條件下將福林試劑(Folin)還原,生成鉬藍與鎢藍,用分光光度法測定,計算其酶活力。1g固體酶粉(或1mL液體酶),1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸為一個酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。該方法精確度較高,但操作流程較繁雜。2.1.2不同膜蛋白的消化法菠蘿蛋白酶將酪蛋白分解成低分子物質,可用縮二脲方法測定在保溫過程中沒有被分解的酪蛋白。開始時投入的酪蛋白數量與用縮二脲試劑測得的反應后的酪蛋白數量之差就等于被酶消化掉的酪蛋白數量。一個酪蛋白消化單位(C.D.U)相當于在試驗條件下分解1mg酪蛋白時所需的酶量。菠蘿蛋白酶的活性是以每克酶消化多少酪蛋白(mg)來表示的,即C.D.U/g。該方法精確度相對較高,操作流程相對較繁雜。該酶活力單位雖然能直觀地表現酶的活力強弱,卻在表示酶活力大小的場合中較少見。不便于與其它方法所測出來的酶活力作直接的比較。2.2促進構建酶活力測定菠蘿蛋白酶在一定的溫度與pH條件下,水解酪蛋白底物,然后加入三氯乙酸終止酶反應,并使未水解的酪蛋白沉淀除去,濾液對紫外光有吸收,可用紫外分光光度法測定。根據吸光度計算其酶活力。1g固體酶粉(或1mL液體酶),1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸為一個酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。該方法所需試劑較少,操作手續較簡便,但靈敏度較低。2.3氨基酸態氮的分解菠蘿蛋白酶從明膠中分解出氨基酸和肽,其氨基酸態氮在與甲醛作用后用滴定法測定。一個明膠消化單位相當于在45℃溫度下,經過20min的消化從一個pH為4.5的標準明膠溶液中分解出1mg氨基酸態氮時所需的酶量。酶的活性是以每克酶分解出多少氨基酸態氮(mg)來表示的,即G.D.U/g。該法為上述菠蘿蛋白酶活力測定方法中最為簡便的,所需試劑也簡單,只是該酶活力單位G.D.U/g與目前常用的酶活力單位U/g之間需要換算一下,才能作出直接的關于酶活力大小的比較。3在其他水