第8章植物細(xì)胞培養(yǎng)及

次生物質(zhì)生產(chǎn)8.1植物單細(xì)胞培養(yǎng)8.2植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)8.3植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。大規(guī)模的需要利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)。植物細(xì)胞培養(yǎng)是在植物組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的。理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在生命體的全部能力（全能性）。8.1植物單細(xì)胞的培養(yǎng)8.1.1單細(xì)胞制備方法8.1.2單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)8.1.1單細(xì)胞制備方法機(jī)械法：主要通過(guò)機(jī)械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單體。如葉肉組織細(xì)胞的分離。由于愈傷組織細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)非常松散，因此可以通過(guò)高頻率振動(dòng)從懸浮狀態(tài)的愈傷組織中振蕩下來(lái)單個(gè)細(xì)胞。方法原始、效率低，細(xì)胞易破，獲得細(xì)胞數(shù)量有限。但操作方便，且不會(huì)改變細(xì)胞的生理特性。化學(xué)方法草酸鹽，秋水仙素，CH，2，4-D等對(duì)分散細(xì)胞有一定作用。酶解法：目前最為有效的一種獲得單細(xì)胞的方法。還可根據(jù)植物細(xì)胞壁的組成特點(diǎn)選用專(zhuān)一性水解酶，在溫和條件下將壁物質(zhì)分解掉，從而釋放出細(xì)胞。該法主要用于制備原生質(zhì)體。果膠酶、纖維素酶等。化學(xué)方法和酶法可獲得大量分散細(xì)胞，但易引起細(xì)胞生理改變。8.1.2單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)8.1.2.1平板培養(yǎng)法是將懸浮培養(yǎng)的分散細(xì)胞均勻分布在一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。具體步驟：?jiǎn)渭?xì)胞懸浮液的制備，并記數(shù)。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。1×103-1×105個(gè)/ml。培養(yǎng)基選擇與凝固劑選擇，30-35℃混勻澆平板。密封后在倒置顯微鏡下標(biāo)記單細(xì)胞位置。25℃，暗培養(yǎng)。數(shù)天后計(jì)算植板率。平板培養(yǎng)注意事項(xiàng)：植板密度不能低于某一臨界值（臨界密度）；添加有機(jī)成分或采用條件培養(yǎng)基，植板密度可以低一些。應(yīng)選用旺盛分裂期細(xì)胞；操作時(shí)減少細(xì)胞損傷；黑暗或弱光培養(yǎng)。1×103~1×105個(gè)/ml。臨界密度：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)時(shí)，初始植板密度低于某值，培養(yǎng)細(xì)胞就不能進(jìn)行分裂和發(fā)育成細(xì)胞團(tuán)，則該值就是臨界密度。初始植板密度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況而改變，培養(yǎng)基越復(fù)雜則植板細(xì)胞的臨界密度越低，反之則相反。8.1.2.2看護(hù)培養(yǎng)是指用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，使其持續(xù)生長(zhǎng)和增殖的一種培養(yǎng)方法。這塊愈傷組織被稱(chēng)為看護(hù)組織。具體方法是將單個(gè)細(xì)胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、成功率高。8.1.2.3微室培養(yǎng)是為了進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的一種微量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。微室培養(yǎng)要求：微室要采用光學(xué)性能好的材料；材料能使小室與外界隔絕，且能保證適當(dāng)?shù)臍怏w交換。合適的培養(yǎng)基。能保證細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。選擇合適的細(xì)胞。處于旺盛分裂期細(xì)胞，壁薄，透明度高。主要指將植物細(xì)胞和小的細(xì)胞團(tuán)懸浮于液體培養(yǎng)基中，在保持細(xì)胞良好分散狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是：能大量提供分散性好且比較均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造條件。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)吸收充分、環(huán)境條件好，細(xì)胞增殖快。可避免有害代謝物在局部濃度過(guò)高。適合大規(guī)模的培養(yǎng)，生產(chǎn)有價(jià)值的活性代謝物。8.2植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)8.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)一般過(guò)程疏松易碎愈傷組織誘導(dǎo)：外植體，基本培養(yǎng)基及有機(jī)附加物（CH、谷氨酰胺等），植物生長(zhǎng)物質(zhì)（2，4-D和細(xì)胞分裂素）的種類(lèi)、濃度和比例等，蔗糖濃度（10-30g/L）等均對(duì)疏松愈傷組織的形成有影響。愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。這樣可獲得大量均勻一致，疏松易碎，適合建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織。單細(xì)胞分離及細(xì)胞懸浮培養(yǎng):選擇合適的接種密度（104-105個(gè)/mL）、溫度，搖床轉(zhuǎn)速等。愈傷組織形成和植株再生：懸浮細(xì)胞可直接形成肧狀體或經(jīng)愈傷組織分化成再生植株（快繁）。

如果以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為目的的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，則應(yīng)采取適當(dāng)措施分散開(kāi)不斷聚集的細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞保持繼續(xù)增殖，達(dá)到最高細(xì)胞密度，收獲目的產(chǎn)物。8.2.2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝8.2.2.1分批培養(yǎng)指在培養(yǎng)過(guò)程中，一次性加入培養(yǎng)基，在一定條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，一次性收獲。即不向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)加培養(yǎng)基，也不從系統(tǒng)中排出培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)“S”形生長(zhǎng)曲線(xiàn)。懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖

延遲期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、直線(xiàn)生長(zhǎng)期、減緩期、靜止期、衰亡期。8.2.2.2連續(xù)培養(yǎng)

指在培養(yǎng)過(guò)程中，連續(xù)地以一定速度添加培養(yǎng)液，同時(shí)排出舊的培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物不斷得到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充并保持培養(yǎng)液總體積不變的培養(yǎng)。封閉式連續(xù)培養(yǎng)：指新老培養(yǎng)液同時(shí)、等量流進(jìn)、流出，回收細(xì)胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞數(shù)目不斷增加。開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)：新鮮培養(yǎng)基的加入和等體積的細(xì)胞懸液的收獲是平衡的，不回收細(xì)胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，而是進(jìn)行收獲，使培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目保持恒定，流出的細(xì)胞數(shù)相當(dāng)于培養(yǎng)系統(tǒng)中新細(xì)胞的增加數(shù)。通過(guò)調(diào)節(jié)流入和流出的速度，培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度永遠(yuǎn)保持接近最高值的恒定水平上。半連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔一定時(shí)間抽取出一定量的細(xì)胞懸液，同時(shí)加入等量的新鮮培養(yǎng)液。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的意義：節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地域限制。有利于對(duì)生態(tài)環(huán)境和珍稀植物資源的保護(hù)。排除病菌和害蟲(chóng)影響。可通過(guò)特定生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一的有效成分。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和一些工業(yè)原料已成為工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑。通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)可以生產(chǎn)相當(dāng)于幾倍或幾十倍完整植株所產(chǎn)生的次生物質(zhì)。具有極大的經(jīng)濟(jì)效益。8.3植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和次生物質(zhì)生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：藥物代謝產(chǎn)物目前采用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物成分主要包括：苷類(lèi)：皂苷、強(qiáng)心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。淄醇：菜油、豆、谷、膽、異巖藻淄醇等。生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。醌類(lèi)：恩醌、萘醌、返醌等。蛋白質(zhì)類(lèi)：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑、植物病毒抑制劑、植物抗生素等。紫杉醇、紫草寧、人參。

天然食品、食品添加劑色素：胡蘿卜素、葉黃素、單寧、黃酮體等。咖啡——可可堿、咖啡堿；海藻——瓊脂；甜菊葉——甜菊苷；辣椒——辣椒素。殺蟲(chóng)劑、殺菌劑從萬(wàn)壽菊——農(nóng)藥唾吩烷；從鷹嘴豆和掃帚艾——三種魚(yú)藤生物堿、灰葉素、魚(yú)藤酮以及除蟲(chóng)菊脂等；從葫蘆巴（香草）——藍(lán)魚(yú)藤酮、粉紅魚(yú)藤酮等殺蟲(chóng)劑；從錦葵葉——生物堿。飼料、精細(xì)化工等產(chǎn)品蠶飼料：桑、蓖麻、榆等。銀膠菌細(xì)胞愈傷組織中生產(chǎn)橡膠。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)主要包括3個(gè)步驟：誘導(dǎo)植物產(chǎn)生旺盛生長(zhǎng)的愈傷組織并建立懸浮細(xì)胞系篩選高產(chǎn)細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中大量培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)并適時(shí)收獲。8.3.1細(xì)胞株的篩選生長(zhǎng)活躍、合成目的產(chǎn)物較多部位取材----愈傷組織培養(yǎng)----液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)以分散細(xì)胞----用單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得單細(xì)胞克隆產(chǎn)生的愈傷組織----測(cè)定其次生代謝產(chǎn)物含量，選出高產(chǎn)細(xì)胞系----繼代多次，產(chǎn)物含量仍高，則為穩(wěn)定的高產(chǎn)細(xì)胞系----可用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。8.3.2培養(yǎng)基的選擇適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基不一定適合目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，因此，采用兩步培養(yǎng)法。首先將細(xì)胞培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，促進(jìn)細(xì)胞快速增殖，然后轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)培養(yǎng)基上促進(jìn)細(xì)胞合成目的次生代謝產(chǎn)物。植物生長(zhǎng)物質(zhì)：2，4-D、NAA、IAA、6-BA、KT等。前體：合成代謝物所必需的前體物質(zhì)。誘導(dǎo)子：能引起植物細(xì)胞某些代謝強(qiáng)度或代謝途徑發(fā)生改變的物質(zhì)。包括生物（微生物或其提取物等）和非生物（輻射、金屬離子等）兩類(lèi)。8.3.3培養(yǎng)條件光：光照時(shí)間、光質(zhì)、光強(qiáng)均有影響。溫度：應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞培養(yǎng)物及合成不同次生代謝物種類(lèi)而定。PH：一般在5-6之間。8.3.4生物反應(yīng)器的選擇適合植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器應(yīng)該具有合適的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和低的剪切力。生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)要總體上考慮以下幾個(gè)重要因素：1) 結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，能耐受蒸汽滅菌，無(wú)害耐蝕材料，內(nèi)壁光滑。2) 有良好的氣－液接觸和液－固混和性能及熱量交換性能。3) 保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量下，盡量節(jié)省能源消耗。4) 減少泡沫的產(chǎn)生，有參數(shù)檢測(cè)和控制儀表，能聯(lián)機(jī)。三種應(yīng)用于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器：機(jī)械攪拌式反應(yīng)器氣動(dòng)式生物反應(yīng)器：鼓泡式、氣升式固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器8.3.4.1攪拌式反應(yīng)器原理：利用機(jī)械攪動(dòng)使細(xì)胞懸浮和通氣。優(yōu)點(diǎn)：攪拌充分，供氧和混合效果好。缺點(diǎn)：剪切力容易傷害植物細(xì)胞。機(jī)械攪拌式反應(yīng)器示意圖8.3.4.2氣動(dòng)式生物反應(yīng)器原理：利用空氣動(dòng)力使培養(yǎng)液流動(dòng)。優(yōu)點(diǎn)：剪切力小，對(duì)細(xì)胞傷害小。易長(zhǎng)時(shí)間無(wú)菌培養(yǎng)。缺點(diǎn)：低氣速細(xì)胞容易聚集，與培養(yǎng)液混合差。高氣速會(huì)產(chǎn)生泡沫，影響植物細(xì)胞生長(zhǎng)。8.3.4.3固定化細(xì)胞生物反應(yīng)系統(tǒng)細(xì)胞固定化是指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物等中，或使其