高效毛細管電泳法

在藥物分析中的應用

山東藥品食品職業學院任玉紅2010年執業藥師繼續教育2023/10/15

該內容共分兩部分進行介紹

第一部分概述

第二部分高效毛細管電泳技術的分離模式及應用2023/10/15第一部分概述

高效毛細管電泳法(HPCE

)又稱毛細管電泳法(capillaryelectrophoresis，CE）。是以毛細管為分離通道，以高壓電場為驅動力，依據供試品中各組分之間淌度（單位電場強度下的遷移速度）和（或）分配行為上的差異而實現分離的新型液相分離分析技術。2023/10/15

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；第一次的自由溶液電泳；一臺電泳儀;Tiselius建立了移動界面電泳，將電泳發展成分離技術。1948年獲得諾貝爾化學獎。2023/10/15

1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——高效毛細管電泳。

1988～1989年出現了第一批毛細管電泳商品儀器。目前，在生命科學、藥物分析、以及從小分子、離子到單細胞分析的一系列領域得到了廣泛的應用。2023/10/15一、高效毛細管電泳法的特點高效毛細管電泳法是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。

與高效液相色譜法（HPLC）相比，其相同處在于都是高效分離技術，儀器操作均可自動化，且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：HPCE用遷移時間取代HPLC中的保留時間，HPCE與HPLC相比，分析速度快；柱效高；所需樣品量及流動相用量少；但HPCE僅能實現微量制備，而HPLC可作常量制備；同時，HPCE沒有泵輸液系統，因此成本相對較低，通過改變操作模式和緩沖液的成分，有很大的選擇性，可以根據不同分子性質（諸如大小、電荷數、疏水性等）對極廣泛的對象進行有效的分離。而HPLC為達到同樣的目的，需要消耗價格昂貴的柱子和大量的溶劑。2023/10/15HPCE和普通電泳相比，由于其采用高電場，因此分離速度快；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外，其它類型檢測器均已和HPCE實現了連接檢測；一般電泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自動化程度比普通電泳要高，與傳統的電泳相比主要有四個特點，即高效、快速、微量和自動化。2023/10/15毛細管電泳技術兼有高壓電泳及高效液相色譜等優點，其突出特點是:

1.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數3.操作模式多，開發分析方法容易4.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質中進行5.應用范圍極廣2023/10/15二、毛細管電泳的基本裝置與操作毛細管電泳的基本裝置由高壓電源、毛細管、檢測器、電解質貯液槽、進樣器、控制系統及數據處理系統組成。

1－溫度控制系統；2－高壓電源；3－高壓電極槽；4－毛細管；5－檢測器；6－低壓電極槽；7－鉑絲電極；8－記錄/數據處理檢測器2023/10/15幾個主要部分的特點:進樣：最常用的進樣方式為流體力學方式和電動方式兩種。分離：分離部件主要包括毛細管、毛細管恒溫系統和電源。毛細管材料應具有化學和電學惰性、紫外可見光透光性、柔韌性、強度高和便宜等特性。熔融石英是毛細管的首選材料，最常用的是內徑為25～75μm的毛細管。檢測：紫外可見光檢測是最常用的檢測方式，但是受到儀器、單波長等因素的限制，目前應用最廣泛的是二極管陣列（PDA）檢測器。液體的處理：該系統包括自動進樣裝置、緩沖液更換系統和緩沖液的水平系統等。2023/10/15完成典型的HPCE實驗，一般包括以下操作步驟：移開進樣端的電解質貯液槽，換上樣品管使用低壓或電遷移方式進樣換電解質貯液槽加上分離電壓樣品分離，用檢測器進行檢測2023/10/15

電泳

是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現象。單位電場下的電泳速度稱為淌度或電遷移率。離子所帶電荷越多，解離度越大，體積越小，溶液粘度越小，有效淌度就越大，其電泳速度就越快。這也是電泳分離及其條件選擇的根本依據之一。

物質離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。三、毛細管電泳法的基本理論2023/10/15電滲

高效毛細管電泳操作中一個基本組成部分是電滲流（electroosmosis，EOF）。電滲流是毛細管內壁表面電荷所引起的管內液體的整體流動，來源于外加電場對管壁溶液雙電層的作用。

CE所用的石英毛細管柱，在pH>3的情況下，其內表面帶負電，和溶液接觸時形成雙電層。在高電壓的作用下，雙電層中的水合陽離子引起流體整體向負極方向遷移的現象叫電滲。電滲流是毛細管中的溶劑因軸向直流電場的作用而發生的定向流動。

2023/10/15電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；

粒子在毛細管內電解質中的遷移速度等于電泳和電滲流（EOF）兩種速度的矢量和，正離子的運動方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現分離。

2023/10/15多數情況下，電滲流速度是電泳速度的5-7倍。因此，在毛細管電泳中利用電滲流可將正、負離子和中性分子一起朝一個方向產生差速遷移，在一次CE操作中同時完成正、負離子的分離測定。由于電滲流的大小和方向可以影響CE分離的效率、選擇性和分離度，所以成為優化分離條件的重要參數。用來控制電滲流的方法主要有改變緩沖溶液的成分和濃度；改變緩沖溶液的pH值；加入添加劑；毛細管內壁改性；外加徑向電場；改變溫度等。2023/10/15四、影響高效毛細管電泳分離的因素1.緩沖溶液

CE中常用的緩沖試劑有：磷酸鹽、硼砂或硼酸、醋酸鹽等。緩沖液濃度升高，離子強度增加，電滲流減小，分析效率提高；同時，增強樣品的富集現象，從而提高分析靈敏度。

2．pH值

pH能影響樣品的解離能力，樣品在極性強的介質中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。

2023/10/153.分離電壓

相對較高的分離電壓會提高分離度和縮短分析時間，但電壓過高又會使譜帶變寬而降低分離效率。

4.溫度的影響

毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。5.添加劑的影響6.進樣2023/10/15

第二部分高效毛細管法的分離模式及應用2023/10/15一、高效毛細管電泳的分離模式1、毛細管區帶電泳(CZE)2、毛細管凝膠電泳(CGE)3、毛細管等速電泳(CITP)4、毛細管等電聚焦(CIEF)5、膠束電動毛細管色譜(MEKC或MECC)6、毛細管電色譜(CEC)2023/10/151、毛細管區帶電泳CZE

將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。正離子在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子在負極最后流出，在這種情況下，不但可以按類分離，同種類離子由于差速遷移被相互分離。

CZE最基本的操作模式，應用最廣泛，是其它各種操作模式的母體。用以分析帶電溶質，如多種蛋白質、肽、氨基酸的分析。2023/10/152、毛細管凝膠電泳

CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。

毛細管凝膠電泳分凝膠和無膠篩分兩類。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺,稱為毛細管無膠篩分。柱便宜、易制備。2023/10/15CGE

是毛細管自由溶液區帶電泳派生出的一種電泳方式，用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質，網狀結構，按分子的大小分離

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1）將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2）負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。3、毛細管等速電泳capillaryisotachophoresis，CITP

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3）不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區帶電場強度小，使溶質按其電泳淌度不同得以分離。4）特點：界面明顯，富集、濃縮作用；常用于分離離子型物質，目前應用不多。2023/10/15

1)緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。4、膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。被分離物質在水和膠束相之間發生分配并隨電滲流在毛細管內遷移，達到分離。

2)電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；2023/10/15

3)中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；特點：1）可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2)色譜與電泳分離模式的結合。2023/10/15

1）根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；2）毛細管內充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的、穩定的、連續的、線性的

pH梯度；3）氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；5、毛細管等電聚焦

CIEF2023/10/15

4）聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離；

5）陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6）加壓將毛細管內分離后的溶液推出經過檢測器檢測；7）電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。

毛細管等電聚焦電泳已經成功用于測定蛋白質等電點，分離異構體等方面。2023/10/15

是將細粒徑固定相填充到毛細管中，或在毛細管內壁涂覆固定相，以電滲流驅動操作緩沖溶液（流動相），使試樣組分在兩相間進行分離的電動色譜過程。此模式兼具電泳和液相色譜的模式。CEC可分為開管CEC（即管壁涂漬固定相）和填充CEC。6、毛細管電色譜

capillaryelectroosmosticchromatography，CEC2023/10/15二、高效毛細管電泳法在藥物分析中的應用

高效毛細管技術在藥物分析中的應用大致可以分為兩部分：一是原料藥的定量、原料藥中雜質的測定、藥物制劑分析以及對它們穩定性的評價等以藥品質量控制為目的的測定方法。二是對進入人體內的藥物或代謝物的吸收、分布、代謝、排泄等體內動態的研究，即臨床藥物分析。

2023/10/15（一）HPCE在藥品質量控制方面的研究應用1．HPCE在中藥分析中的應用具有分離效率高、分析速度快、分析時間短、樣品前處理簡便、進樣量少、有機溶劑消耗少、操作簡便、分析成本低等優點。另外，HPCE在中藥復方制劑復雜成分分析中還具有以下優越性：(1)毛細管柱易于全面清洗，可保持高柱效而使復雜成分較好分離；(2)分離模式多，適合于中藥制劑中各類化學成分的分析；(3)不同