為使基因擴增檢查技術有效地應用于臨床,更加好地為疾病的防止、診療和治療服務,保證檢查質量,特制訂本規范。一、臨床基因擴增檢查實驗室的規范化設立及其管理臨床基因擴增檢查實驗室的規范化設立詳見《臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法》（衛醫發［］10號文附件《臨床基因擴增檢查實驗室基本設立原則》.為避免污染，必須嚴格遵照《臨床基因擴增檢查實驗室設立原則》設立臨床基因擴增檢查實驗室。臨床基因擴增檢查實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵照單一方向次序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反映混合物配制和擴增區（簡稱擴增區至產物分析區,避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，方便于鑒別。另外，當工作者離開工作區時,不得將各區特定的工作服帶出。清潔辦法不當也是污染發生的一種重要因素，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行.不同的實驗區域應有其各自的清潔用品以避免交叉污染。(一試劑貯存和準備區下述操作在該區進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反映混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運輸至試劑貯存和準備區，不能通過產物分析區。在打開含有反映混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數秒.試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后，應將其分裝貯存備用,避免由于經常打開反映管吸液而造成污染。含反映混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反映取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據普通在實驗室內一次測定所需的擴增反映數來決定。主反映混合液的構成成分特別是聚合酶的合用性和穩定性通過預實驗來檢查，評價成果必須有書面報告.對于"熱啟動"技術(在第一種高溫變性環節后加入酶,聚合酶也可不包含在主反映混合液中。在整個本區的實驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經常更換。另外,操作中使用一次性帽子也是一種有效地避免污染的方法。嚴禁用嘴吸取液體,加樣器和吸頭等必須經高壓解決。工作結束后必須立刻對工作區進行清潔。本工作區的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常核心,因此可使用可移動紫外燈（254nm波長,在工作完畢后調至實驗臺上60-90cm內照射。由于擴增產物僅幾百bp,對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最佳是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常統計。（二標本制備區下述操作在該區進行:臨床標本的保存,核酸(RNA、DNA提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。要對的使用加樣器.由于在加樣操作中可能會發憤怒溶膠所致的污染，因此應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反映混合液的反映管.對含有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本解決和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液容器內.實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等如出現外濺，則必須分別解決并作出統計。對實驗臺適宜的紫外照射(254nm波長，與工作臺面近距離適合于滅活去污染.可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充足照射。樣本解決對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取辦法，可在開展臨床標本檢測前對提取辦法進行評價.用于RNA擴增檢測的樣本制備好后來,應立刻進行cDNA合成,由于cDNA鏈較RNA穩定，保存相對容易。為確保逆轉錄反映的需要，應在標本制備區設立一種以上的溫育裝置。cDNA合成的抱負溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法:即使用在擴增反映緩沖液條件下含有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄,其較cDNA合成后再開蓋以調節緩沖液或加入聚合酶進行擴增發生污染的可能性減少.待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區，不得在本區對樣本進行PCR擴增.（三擴增區下述工作在本區內進行:DNA或cDNA擴增。另外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區的加入和主反映混合液（來自試劑貯存和制備區制備成反映混合液等也可在本區內進行.在巢式PCR測定中，普通在第一輪擴增后必須打開反映管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。不能從本區再進入任何"上游”區域，可減少本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出.為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預解決過的反映混合液時必須避免液體濺出,特別是在巢式擴增環節之間。一種簡樸的辦法是在打開反映管前快速離心數秒。可使用體積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數超凈臺.防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也含有防污染作用，但必須注意的是,礦物油本身也可能成為一種持續性的污染源.用過的加樣器必須注意清潔消毒.完畢操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射辦法與前面區域相似。如有溶液濺出，必須解決并作出統計.(四擴增產物分析區下述操作在本區內進行:擴增片段的測定。核酸擴增后產物的分析辦法多個多樣，如膜上或微孔板上探針雜交辦法（同位素標記或非同位素標記、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序辦法等.現在國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交辦法，PCR—ELISA辦法，也有膜上探針雜交辦法。本區是最重要的擴增產物污染來源,因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR—ELISA辦法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/LHC1中，并且不能在實驗室內傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉.用過的吸頭也必須放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序解決，如焚燒。由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。本區的清潔消毒和紫外照射辦法同前面區域。本區如采用負壓條件或減壓狀況下(如安裝排電扇可減少擴增產物從本區擴散至前面區域的可能性.二、臨床基因擴增檢查實驗室質量確保臨床基因擴增檢查實驗室質量確保涉及到整個基因擴增檢查的全部階段,即測定分析前的標本采集解決、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的成果報告等。（一標本的采集慣用于基因擴增檢測的臨床標本涉及EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等.采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器,如真空采血管.當使用非密閉采樣系統時,如尿、分泌物和骨髓的采樣,必須注意避免來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應高壓解決,由于玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最佳是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝解決.EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑.不能使用肝素抗凝,由于肝素是Taq酶的強克制劑，并且在其后的核酸提取環節中很難去除。臨床用于RNA（如HCVRNA擴增檢測的血標本建議進行抗凝解決，并盡快(3小時以內分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝解決，則抽血后,必須在1小時內分離血清。(二標本的穩定化解決用于DNA擴增檢測的標本，采集后普通不需要特殊的穩定化解決,但標本應及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化解決，如流行病學調查的現場采樣.異硫氰酸胍鹽（GuanidineThiocyanate，GITC可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時,可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/LGITC的試管中,從而使血清（漿中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化解決后，標本普通不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩定化解決辦法的效果終究如何，要使用對應的逆轉錄PCR測定辦法來評價。（三標本的運輸標本采集后必須盡快送至實驗室。通過適宜穩定化解決的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化解決的標本。普通在運輸時，應采用不易破碎的容器裝載標本.用于RNA檢測的標本,如果未經穩定化解決，則必須速凍后,放在干冰中運輸。(四標本的貯存臨床體液標本如血清/血漿等可于—70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/LTris—1mmol/LEDTA緩沖液（pH7.5-8。0中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中—80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在—20℃即可.用GITC解決的RNA標本在室溫可保存7天.(五標本的解決（核酸提取標本解決即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的核心性環節，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充足評價以驗證其提取的有效性。普通，核酸制備質量不高是由于克制物去除不完全所致,克制物可能來源于標本本身（如血紅素及其前體或降解產物或核酸提取過程中殘留的有機溶劑（如酚、氯仿等，這些物質對其后的Taq酶擴增反映環節含有強烈的克制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化解決，再提取核酸。需注意的是,液化時不能加熱，液化時間不能過長。另外，當靶核酸為RNA時，逆轉錄PCR測定失敗的常見因素是標本在運輸前未經充足的穩定化解決及核酸提取試劑的RNA酶的污染.對于前者,要核查測定分析前的環節，如果發現有RNA降解的證據，實驗室則應回絕接受標本,規定重新采用標本,并對運輸者給以具體的指導.對于后者,建議使用高質量的商品核酸提取試劑。（六靶核酸的逆轉錄（RT和擴增1、靶RNA的逆轉錄cDNA合成為逆轉錄PCR中的第一種酶反映環節，所產生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈,為背面擴增的模板。下述因素普通影響cDNA合成的效率：(1逆轉錄效率的減少或完全缺少。其可能的因素有逆轉錄酶質量不高、試劑降解變質或加樣錯誤等；(2用于逆轉錄的標本中存在逆轉錄或Taq酶的克制物（如酚、氯仿、血紅素等；（3RNA酶的存在造成RNA的降解.2、核酸的擴增有多個因素可引發核酸擴增檢測的假陽性或假陰性成果，如擴增靶核酸中克制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等.擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要，必須定時對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查，以避免假陰性成果。(七污染在實際工作中,常見有下列幾個污染類型:擴增片段的污染（產物污染;天然基因組DNA的污染、試劑污染（貯存液或工作液以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一種陽性標本擴散到原本陰性的標本.臨床基因擴增檢查實驗室中污染的最重要來源是擴增產物的污染。由于一旦發生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時并且還很繁瑣，因此避免污染重在防止.但如果發生了污染,實驗就必須停止，直到發現了污染源為止，并且實驗成果必須作廢.1、測定分析前的污染源測定分析前實驗材料的污染重要來自非病人標原來源的核酸.2、測定分析階段的污染源普通,測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反映混合液的任何成分及核酸的制備和反映建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油、商品酶制劑、消耗品（如反映管，吸頭和實驗設備（如加樣器、離心機等.在前面三個工作區中,不當的實驗操作會引發所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區,當吸取擴增產物用于檢測時，非常容易引發污染，因此必須制訂原則操作程序（SOP，并嚴格執行.3、污染的避免要避免污染，首先應是防止而不是排除污染，前面所述對工作區的嚴格劃分的目的即是為了防止污染。為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染,可設法將其破壞掉.如在擴增反映中用dUTP取代部分dTTP，使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反映混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG,可破壞來自以前測定的擴增產物，從而避免其對后來要進行的擴增測定的污染。另外一種辦法是持續的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反映但又不妨礙PCR后雜交過程,因此這種辦法也能避免污染。上述防污染辦法只在一定程度上有效,因此不能用其來替代嚴格的實驗室設立和管理,特別是這些辦法不能避免外來非擴增的天然DNA的污染。4、去除污染的方法工作完后必須定時對實驗室采用有效的去污染方法,結合多個不同的辦法可達成最佳效果。去污染方法涉及但不僅限下面幾個:(1用10％(v/v次氯酸鈉清潔表面；（2實驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其它表面；(3實驗設備如加樣器的高壓消毒。（八擴增產物的分析擴增產物的測定有多個辦法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等,但臨床PCR檢查項目基本上都使用探針雜交辦法。雜交成果不充足的因素可能是基因探針不適宜、標記辦法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌辦法不適宜等。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義RNA探針。探針的標記物慣用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。在擴增后的雜交檢測中,應當嚴格恪守商品試劑盒擬定的雜交程序和雜交條件.溫度太低或離子強度太高都會減少雜交的嚴格性,還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反,提高溫度和/或減少離子強度會增加雜交的嚴格性.因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性成果的先決條件.要注意的是，溫度和離子強度不能同時變化。（九質量控制質量控制涉及兩個方面，即室內質量控制(下列簡稱質控和室間質量評價。1、室內質量控制必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制，以避免假陽性和假陰性，確保測定成果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，因此標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都規定有質控方法。（1標本制備：慣用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA與否發生降解.用常規的手工提取辦法制備的DNA的平均長度普通為~100kb,用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范疇為30—40kb。明顯出現降解的DNA（在1和10kb的低分子量范疇內在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶(如EcoRI消化DNA，然后電泳分離，能夠對酶活性的克制劑進行質控(在克制劑存在的狀況下，高分子量的片段不被酶切.潛在的克制劑的存在普通用260nm和280nm的分光光度測定來預計，質量好的DNA提取物，A260/A280比值應當在1。75—2。0之間；否則，殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色辦法不能對DNA的完整性下結論.最快的對總RNA提取質量控制的辦法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點跟DNA分離相似。但如果對成果有疑問,就應當在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在抱負狀況下,三種重要的核糖體RNA(28S、18S和5S在凝膠上出現的帶相對較窄.如發生RNA的降解，則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的原則；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評定也是RNA完整性的適宜的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些因素，單獨的光度計比色辦法也不能對RNA的完整性下結論.對于血清(漿中病毒的測定,則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽狀況下標本解決方法對擴增檢測的影響，避免由于標本解決辦法的不當而出現假陰性成果.另外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取辦法的效果。(2逆轉錄和擴增：本部份涉及陽性質控和陰性質控。對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控辦法也可采用外標質控辦法。逆轉錄—擴增檢測的內標普通為在整個細胞周期中均勻體現的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。另外,也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增.當標本中存在逆轉錄克制物，或核酸提取中發生RNA降解,或逆轉錄酶失活，內標即會體現為陰性成果.對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因,如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監控每一擴增孔中假陰性的產生狀況。現在的商品試劑盒大部分沒采用內標辦法質控.因此