引言在許多的細胞生命活動中，例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題。

重組DNA技術的發展，人們已分離到了許多重要的基因。現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性。為此需要：

a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；

b、分離并鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；

這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用。

研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：

a、凝膠阻滯實驗；b、DNase1足跡實驗；

c、甲基化干擾實驗；d、體內足跡實驗；f、拉下實驗。

二、凝膠阻滯實驗

1、概念：凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNAmobilityshiftassay）或條帶阻滯實驗（Bandretardationassay）是在八十年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。

2、原理：

在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比。如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，于是朝正極移動的距離也就相應的縮短，因而在凝膠中出現滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。

3、過程:

1)首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）

2)用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）

3)這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，于是產生DNA-蛋白質復合物

4)在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

5)最后進行放射自顯影，分析電泳結果

4、實驗結果的分析：

a、如果有放射性標記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；

b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質。

5、DNA競爭實驗：

DNA競爭實驗（DNAcompetitiveassay）的具體做法如下：

在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitorDNA），如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結合狀態，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；

如果反應體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子，結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶。

6、應用：

a、凝膠阻滯實驗可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；

b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；

c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的堿基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；

d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子。

三、足跡實驗

1、定義:

足跡實驗（foot-printingassay），是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。

2、原理：當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之后便可以得到保護而免受DNaseI酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，俗稱為“足跡”。

3過程：將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5‘末端標記，并用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端，于是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA

在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質復合體

在反應混合物中加入少量的DNaseI,并控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：

a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質，使DNaseI消化之后，便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸------等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；

b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合，被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNaseI酶的降解作用；

除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組:

a、實驗組：DNA+蛋白質混合物

b、對照組：只有DNA，未與蛋白質提取物進行溫育

最后進行放射性自顯影，分析實驗結果。

4、結果判斷:

實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列。

5、其他的足跡實驗方法：

除了DNase1足跡試驗之外，目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如：

a、自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗

DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理

DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割。如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合，就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。

四、甲基化干擾實驗

1、概念：

甲基化干擾實驗（Methylationinterferenceassay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法。

應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化，對爾后的蛋白質結合作用究竟會有仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。ChIP的一般流程：甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP