蘭大《藥物分析》離線作業答案液相色譜法是一種以液體為流動相的色譜法。高效液相色譜法（HPLC）是在傳統液相色譜法的基礎上發展起來的一種色譜方法。相比傳統液相色譜法，HPLC具有顆粒極細的固定相、高壓輸液泵、高靈敏檢測器等優點，使其在藥物分析中應用廣泛。HPLC按照分離機理的不同可分為吸附色譜法和液-液分配色譜法。吸附色譜法以吸附劑為固定相，流動相一般使用有機溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。液-液分配色譜法的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數（K)的不同而被分離。鍵合相色譜法是HPLC中應用最廣的色譜法，使用化學鍵合固定相的色譜方法可以用分配色譜的原理加以解釋。按照固定相和流動相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。正相色譜法使用極性較強的固定相和非極性的流動相，反相色譜法則相反。HPLC在藥物分析中的應用主要包括鑒別、檢查和含量測定。鑒別主要是通過比較待測藥物與已知藥物的保留時間和峰形來確定其成分；檢查則是通過對藥物中雜質的分離和檢測來評估藥品的質量；含量測定則是通過測定藥物中有效成分的含量來確定藥品的規格和質量。隨著HPLC技術的不斷發展，其應用范圍將會更加廣泛。正相分配色譜法是一種固定相極性小于流動相極性的分配色譜法，簡稱為正相色譜法。正相色譜常用的固定相是氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學鍵合固定相，而流動相一般為極性較小的有機溶劑。在正相色譜中，極性小的組分先流出，而極性較大的組分后流出。正相色譜法適用于極性及中等極性的分子型物質的分離。反相分配色譜法是一種固定相極性小于流動相極性的分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用的固定相是非極性的，最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛烷基硅烷鍵合硅膠等。而流動相則常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中，極大的組分先流出，而極性較小的組分后流出。當流動相中有機溶劑的比例增加時，流動相極性減小，洗脫力增強。反相色譜法是目前應用最廣的高效液相色譜法。離子對交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的PH值下，這些基團將解離，吸引相反電荷的物質。由于離子型物質能與柱填料反應，所以可被分離。離子交換色譜的流動相一般為一定PH值的緩沖溶液，有時也加入少量的有機溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動相中的溶解度。離子交換色譜法適用于分離在測定條件下呈離解狀態的組分，如具有酸性或堿性的化合物。空間排斥色譜法是以空間排斥作為分離機制的一種色譜法。在空間排斥色譜中，固定相一般為聚合物凝膠，而流動相則是溶劑或緩沖液。分離的機理是由于分子間的空間阻礙，大分子先流出，而小分子后流出。空間排斥色譜法適用于分離大分子化合物，如蛋白質、多糖等。但對人的治療效果卻有很大差異。因此，對手性化合物的分離具有重要意義。手性色譜法是一種有效的手性化合物分離方法。其原理是利用手性固定相與手性化合物之間的選擇性相互作用，將手性化合物分離。手性固定相是手性化合物與聚合物或硅膠等固體載體通過化學鍵連接而成，具有一定的空間結構，能夠與手性化合物發生特異性的相互作用。當樣品溶液通過手性色譜柱時，手性化合物與手性固定相發生相互作用，形成手性復合物，從而實現手性化合物的分離。手性色譜法可以分離各種手性化合物，如藥物、天然產物等。只有左旋異構體才具有胚胎毒性和致畸作用，因此對映體的分離在藥物制備和質量控制方面具有重要意義。對映體在普通條件下的理化性質相同，因此需要在手性條件下進行分離，手性色譜法是分離對映體的常用方法，分為間接法和直接法兩種。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多。手性藥物的對映體通常以鏡像存在，即以外消旋體形式存在。常規分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對稱環境，使欲拆分的對映體、手性作用物和手性源形成一個非對映異構分子的絡合物。為了形成這樣一種分子絡合物，分子之間要有一種同時相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。常用的手性固定相有Pirkle型手性固定相和蛋白質類手性固定相。Pirkle型手性固定相是由美國學者Pirkle主持研制的，主要有π-堿性和π-酸性手性固定相。在分離的過程中，化合物與固定相之間發生π-π電荷轉移相互作用，此類固定相為電荷轉移型手性固定相。蛋白質類手性固定相是將蛋白質通過氨基酸鍵合到硅膠上而制成的，常用的有牛血清蛋白和人血a1-酸性糖蛋白的手性固定相。蛋白質類手性固定相被廣泛應用，效果良好，但譜柱容量較小。常用的洗脫系統是磷酸鹽緩沖溶液，離子強度為500mmol，有機改性劑不得超過5%。在使用蛋白質類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對映體時，流動相內可分別加少量離子對試劑，如N，N-二甲基辛胺、叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結果。多糖類手性固定相中最常用的是環糊精。環糊精是一種手性高分子物質，由6、7、8個D-吡喃葡萄糖組成，分別被稱為α、β、γ環糊精。將環糊精通過硅烷鏈連接在硅膠表面上，就構成了環糊精手性固定相。在使用環糊精手性固定相進行分離時，需要被拆分的組分進入環糊精的內腔形成包合物，保留時間取決于組分進入洞穴的能力和緊密程度。環糊精還具有多個手性中心，能夠選擇性地與對映體作用，從而導致對映異構體的保留不同而被分離。除環糊精外，多糖類手性固定相還可以使用纖維素、直鏈淀粉等制成。冠醚類手性固定相也是一種常用的手性固定相。冠醚是一種含醚鍵的環狀化合物，具有王冠狀結構，外層是親脂性的乙撐基，內層是富電子的雜原子。常用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙炔骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。在使用冠醚手性固定相分離對映體時，不同對映異構體因與冠醚環腔形成的主客體絡合物的穩定性不同而被分離。在冠醚上引入雙萘基，可以形成“手性墻”，增加固定相的立體選擇性。能質子化的氨基化合物，特別是氨基酸對映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。手性流動相拆分法是一種新型的手性分離方法，它是通過改變流動相的手性來實現對映體的分離。手性流動相可以是手性溶劑、手性添加劑或手性離子對試劑。在手性流動相拆分法中，需要選擇合適的手性流動相和手性固定相，以獲得理想的分離效果。進樣器是將待分離樣品引入色譜柱的重要組成部分。常用的進樣方式有手動進樣和自動進樣兩種。手動進樣適用于樣品量較少的情況，通常采用微量注射器進行進樣。自動進樣器則適用于大批量樣品的分析。自動進樣器可根據需要進行不同的進樣方式，如全自動進樣、微量進樣、分步進樣等。進樣器的選用應根據樣品的特性、進樣量和精度要求等因素進行選擇。（三）色譜柱系統高效液相色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，它是實現分離的關鍵。常用的色譜柱包括反相色譜柱、離子交換色譜柱、凝膠過濾色譜柱等。反相色譜柱是最常用的一種，其固定相一般為碳鏈烷基硅膠，分離機理是根據樣品在固定相與流動相之間的親疏性差異進行分離。色譜柱的選擇應根據樣品的性質、分離要求和流動相的特性等因素進行選擇。（四）檢測系統高效液相色譜的檢測方式多種多樣，常用的檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器等。其中，紫外檢測器是最常用的一種，其工作原理是利用樣品在紫外光下的吸收特性進行檢測。熒光檢測器則是利用樣品在激發光下的熒光特性進行檢測。電化學檢測器則是利用樣品在電極上的電化學反應特性進行檢測。（五）數據記錄處理系統高效液相色譜的數據處理系統包括數據采集、數據處理和結果輸出三個部分。數據采集主要是將檢測器檢測到的信號轉換為數字信號進行記錄。數據處理則是對采集到的數據進行處理，包括峰面積計算、峰高計算、定量分析等。結果輸出則是將處理后的結果輸出到打印機或計算機上進行保存或打印。數據記錄處理系統的選擇應根據實際需要進行選擇。進樣器是一種用于將樣品送入色譜柱的設備。為了保證進樣裝置的密封性好、死體積小、重復性好，進樣時對色譜系統的壓力和流量影響小，常使用進樣閥和自動進樣裝置。六通進樣閥是手動進樣的常用裝置，具有使用方便和進樣量準確等優點。樣品環可用于貯液和測量樣品溶液的體積，進樣時可使用滿環進樣或定量環進樣方式。定量環進樣精度高，適用于使用外標法的操作方式。色譜柱是色譜分離的核心，為了保證柱效高和使用壽命長，一般使用由專業工廠生產的商品柱。色譜柱管多由不銹鋼制成，內裝一定的固定相。化學鍵合相是廣泛使用的固定相，其中以ODS應用最為廣泛。非極性化學鍵合相用于反相色譜法，中等極性的化學鍵合相有苯基化學鍵合相等，極性的化學鍵合相一般用于正相色譜法。吸附色譜的固定相中使用最多的是硅膠。使用能指標包括柱壓、理論塔板高度和理論塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性等。檢測器是色譜儀的重要組成部分，常用的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、質譜檢測器等。紫外檢測器是最常用的檢測器之一，可以檢測吸收紫外光的化合物。熒光檢測器可檢測具有熒光性質的化合物，電化學檢測器可檢測具有電活性的化合物，質譜檢測器可對化合物進行分子結構分析。選擇檢測器時需考慮檢測靈敏度、選擇性、線性范圍和響應時間等因素。熒光檢測器是一種專屬型檢測器，只能檢測具有熒光性質的組分。熒光檢測器在高效液相色譜分析中應用廣泛，特別是在生物、醫藥、環境等領域。熒光檢測器的工作原理是利用分離出的組分在激發光的作用下發射出熒光，熒光強度與組分濃度成正比。熒光檢測器的優點是靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬、重現性好、可用于梯度洗脫等。熒光檢測器的缺點是需要特定的激發光源，有些組分不具有熒光性質，不能檢測。3．示差折光檢測器示差折光檢測器是一種通用型檢測器，可以檢測大多數化合物，特別是不具有紫外吸收或熒光性質的化合物。它的工作原理是利用樣品與參比溶液之間的折射率差異或濃度差異產生的光學信號進行檢測。示差折光檢測器的優點是靈敏度高、線性范圍寬、可用于梯度洗脫等。示差折光檢測器的缺點是對溫度和流動相的波動敏感，需要使用恒溫器和穩定的流動相。4．蒸發光散射檢測器蒸發光散射檢測器是一種通用型檢測器，可以檢測不具有紫外吸收或熒光性質的化合物，尤其適用于大分子化合物的檢測。它的工作原理是利用樣品在高溫下蒸發產生的氣體分子與光子發生相互作用，產生光散射信號進行檢測。蒸發光散射檢測器的優點是對樣品的分子量不敏感，不需要參比溶液，可用于梯度洗脫等。蒸發光散射檢測器的缺點是靈敏度低，需要較高的樣品濃度才能檢測到信號。熒光檢測器利用組分發出的熒光進行檢測，其靈敏度比紫外檢測器高，檢測限可以達到1×10-10g/ml，但組分必須具有熒光。許多藥物和生物活性物質具有天然熒光，能夠直接檢測，例如生物胺、維生素和甾體化合物。通過熒光衍生化可以使本來沒有熒光的化合物轉變成熒光衍生物，從而擴大了熒光檢測器的應用范圍，例如氨基酸。由于熒光檢測器的高靈敏度和選擇性，它是體內藥物分析常用的檢測器之一。蒸發光散射檢測器是一種新型的通用型檢測器，主要適用于無紫外吸收，不能用紫外檢測的組分，例如糖類、脂肪酸、甘油三酯及甾體等。ELSD的檢測可分為三個步驟：首先在霧化器中，洗脫液通過1個針孔與氮氣（也可以用空氣）混合，形成均勻的霧狀液滴；然后流動相蒸發液滴通過加熱的漂移管時，流動相被蒸發，樣品組分形成氣溶膠，進入檢測室；最后，在檢測室內，用激光來照射氣溶膠，產生散射，測定散射光強，記錄散射光強度隨時間的變化關系，就得到了色譜圖。ELSD用來測定那些不能用紫外檢側器檢側的組分，對HPLC的檢測器是很重要的補充。但是ELSD對有紫外吸收的組分檢測靈敏度相對較低，且只適用于流動相能完全揮發的色譜條件，若流動相含有難以揮發的緩沖劑時，就不能用ELSD進行檢測。液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）是用質譜作為HPLC的檢測器，它將HPLC的高分離效能和質譜的高靈敏度、高專屬性、通用性及較強的結構解析能力相結合，成為藥品質量控制、體內藥物分析和藥物代謝研究的最重要的手段。由于質譜的工作系統是處于真空狀態的，若將液相色譜的流出液直接引人質譜儀，流出液揮發產生的大量氣體，會使質譜儀無法正常工作。因此，LC-MS的關鍵是接口，目前應用較多的接口有粒子束（PB）接口等。使用粒子束接口時，來自HPLC的洗脫液會通過霧化器霧化，變成氣溶膠微粒。在這個過程中，使用的工作氣體是氦氣。溶劑會在脫溶劑室被蒸發，然后進入動量分離器。由于溶劑和測定組分的質量差別很大，二者之間會出現動量差。動量較小的溶劑和噴射氣體（氦氣）被抽氣泵抽走，而測定組分則沿傳輸管進入質譜儀的離子源。使用粒子束接口時，可使用EI（電子轟擊離子源）或CI（化學離子源），因而可以得到經典的質譜圖，并可以使用圖譜庫檢索，對未知樣品的分析非常有用。然而，它不適用于對熱不穩定的化合物的分析。熱噴霧接口（TSP）是一種在液態下將樣品分子離子化的方法。流動相在經過噴霧探針時被加熱，體積膨脹后以超聲速噴出探針，形成霧滴。液滴在離開噴嘴時由于統計漲落分別帶上多余的正電荷或負電荷。當它在運動中不斷失去溶劑時，液滴的半徑足夠小時，表面電荷會形成很強的電場，導致組分離解。也可以采用熱燈絲發射電子束轟擊溶劑和測定組引發化學電離。TSP適用于含水比例較高、流速較高（1ml/min～2ml/min）以及極性較大的測定組分的分析。大氣壓離子化（API）接口是指在常壓下進行離子化的接口。API是目前LS-MS中應用最廣的接口，有電噴霧(ESP)、離子噴霧(ISP)和大氣壓化學電離(APCI)三種操作模式。現代HPLC的特征是用微機控制儀器。HPLC儀器的中心計算機控制系統，即能做數據采集和分析工作，又能程序控制儀器的各個部件，還能在分析一個試樣之后自動改變條件而進行下一個試樣的分析。許多色譜儀的軟件系統具有方法認證功能，使分析工作更加規范化。高效液相色譜法分離效能高，應用范圍廣，靈敏度高，儀器已較成熟、普及，在新藥的研究開發，藥品檢驗，生物樣品的分析中應用十分廣泛。為保證測定結果的準確，中國藥典規定，在進行色譜分析前需檢查色譜系統是否正常，是否符合要求。即需要作色譜系統適用性試驗，試驗內容包括：記錄色譜圖并量出測定組分或內標物質峰的保留時間tR和半高峰寬（Wh/2），然后按下式計算色譜柱的理論板數：β-羥基-黃體酮等有關物質，這些物質的含量很低，需要采用HPLC法進行檢查。檢查時，可采用色譜柱分離，以UV檢測器檢測，檢測波長為240nm。在檢測過程中，應注意保持色譜柱的溫度和流速穩定，保證分離效果和峰的對稱性。若有關物質的含量超過規定的限度，則應更換色譜柱或其他條件，以達到要求。示例二：對氨基苯甲酸鈉中未知雜質的檢查對氨基苯甲酸鈉是一種鎮痛藥，藥物中可能存在未知的雜質。為了檢查這些雜質，可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進行檢查。主成分自身對照法是指將藥物樣品與對照品進行比較，找出主要的差異成分，以此來檢查未知雜質。峰面積歸一化法是指將藥物樣品和對照品的峰面積進行比較，以此來檢查未知雜質。在檢查過程中，應注意保持色譜柱的溫度和流速穩定，保證分離效果和峰的對稱性。若發現未知雜質的含量超過規定的限度，則應采取相應的措施，以確保藥物的質量和安全性。中國藥典采用高效液相色譜法檢查羥基-黃體酮等物質。檢查方法為先稱取適量的供試品，加甲醇溶解并稀釋制成1mg/ml的溶液作為供試品溶液，再精確取供試品溶液和對照溶液各10ul進樣，記錄色譜圖。色譜條件為采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，流動相為甲醇-水（65:35），檢測波長為254nm。規定供試品溶液雜質峰數不得超過1個，其面積不得大于對照溶液主峰面積的3/4，限量為1.5%。高效液相色譜法是一種專業性強、靈敏度高的檢測方法，在藥物含量測定中應用廣泛。在中國藥典中，合成藥及其制劑的含量測定采用高效液相色譜法可以消除藥物中的雜質，避免制劑中的附加劑及共存藥物對測定的干擾。對于中藥材及其制劑，由于其組成復雜，含量測定也越來越多地采用高效液相色譜法。中國國家藥品質量標準采用容量法分別測定復方對乙酰氨基酚片中對乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因三種藥物的含量。而USP（24）則采用高效液相色譜法同時分離并測定三個組分的含量。該方法簡便、準確，色譜條件為采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，流動相為水-甲醇-冰醋酸（69:28:3），檢測波長為UV275nm，柱溫為45℃，流速約為2.0ml/min。在制備標準溶液前，需要先制備內標溶液和標準貯備液。內標溶液為苯甲酸的甲醇溶液，每1ml約含苯甲酸6mg。標準貯備液則需要分別精確稱取對乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因對照品適量，加混合溶劑甲醇-冰醋酸(95:5)溶解并稀釋至已知濃度。其中對乙酰氨基酚的濃度為0.25mg/ml，阿司匹林的濃度為0.25jmg/ml（j為阿司匹林和對乙酰氨基酚標示量的比值），咖啡因的濃度為0.25j'mg/ml（j'為咖啡因和對乙酰氨基酚標示量的比值）。最后，制備標準溶液需要取20ml標準貯備液和3ml內標溶液，置于50ml量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度并搖勻。其中對乙酰氨基酚的濃度為0.1mg/ml，阿司匹林的濃度為0.1jmg/ml，咖啡因的濃度為0.1j'mg/ml。供試品溶液制備：取不少于20片復方對乙酰氨基酚片，精密稱定后充分研磨，再精密稱取適量（約相當于250mg對乙酰氨基酚），加入100ml量瓶中，加入混合溶劑75ml，振搖30分鐘，加入混合溶劑稀釋至刻度，搖勻后濾過，再精密量取續濾液2ml，加入內標溶液3ml，置于50ml量瓶中，加入混合溶劑稀釋至刻度。測定方法：將對照品溶液和供試品溶液各取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖并測定峰面積值，按照下式計算供試品中各測定組分的含量：含量（mg）=2500C（Ru/Rs），其中C為標準溶液中測定組分的濃度（mg/ml），Ru和Rs分別為供試品溶液和標準溶液中測定組分與內標峰面積的比值，2500為稀釋倍數。手性分離示例三：蛋氨酸對映異構體的分離，使用冠醚類手性固定相適用于氨基酸對映體的分離。使用以下條件分離蛋氨酸，兩個對映體可以得到完全分離：色譜柱為CROWNPAKCR(+)手性柱，流動相為pH1.5的HClO4溶液-甲醇（85:15），流速為0.6ml/min，柱溫為24℃，紫外200m檢測。蛋氨酸對映體的