第二十一章分子生物學常用技術ThePopularTechnologyinMolecularBiology9/2/20231第二十一章分子生物學常用技術8/3/20231第2節PCR技術第3節轉基因技術與基因剔除技術第1節分子印跡與雜交技術第6節蛋白質與核酸相互作用研究技術第4節生物芯片技術第5節蛋白質相互作用研究技術9/2/20232第2節PCR技術第3節轉基因技術與基因剔除技術第1節第一節

分子印跡與雜交技術

MolecularBlotting&HybridizationTechnology9/2/20233第一節

分子印跡與雜交技術

MolecularBlott一、核酸分子印跡與雜交技術指具有一定互補序列，不同來源的核苷酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補配對的原則形成雙鏈的過程。核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)印跡(blotting)指利用各種物理方法，使電泳凝膠中的生物大分子轉移到硝基纖維膜等特定的支持物上，使之成為固相化分子的過程。9/2/20234學習要求1一、核酸分子印跡與雜交技術指具有一定互補序列，不(heteroduplex)9/2/20235(heteroduplex)8/3/20235探針(probe)探針種類標記物指可用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的,與被測序列互補并經過特殊標記的DNA或RNA片段。寡核苷酸基因組DNAcDNA片段RNA片段放射性同位素地高辛生物素熒光染料r-32PATPa-32PdATP9/2/20236HdATP**探針(probe)探針種類標記物指可用來檢測某一特定9/2/20237dUTPDig-dUTPBiotin-dUTP非放射性標記物8/3/20237dUTPDig-dUTPBiotin-dUDig-DNA探針雜交化學發光信號檢測原理

Luminol化學發光原理Dig-DNA探針雜交化學發光信號檢測原理Luminol化Biotin-DNA探針雜交化學發光信號檢測原理

Luminol化學發光原理BiotinAvidinBiotin-DNA探針雜交化學發光信號檢測原理Lumin（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交。基本過程:

將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測DNA片段變性，再將凝膠中的DNA分子轉移到硝基纖維膜等固相支持物上，然后用標記的探針檢測待測的DNA。可用于基因組DNA的定性與定量分析，重組質粒和噬菌體的分析等。9/2/202310（一）Southern印跡雜交Southern印跡Southern印跡雜交的基本步驟:

①待測DNA樣品的限制性內切酶消化②酶切DNA樣品的電泳分離③凝膠中DNA的變性和Southern印跡

④探針的制備⑤Southern雜交⑥雜交結果的檢測9/2/202311Southern印跡雜交的基本步驟:①待測DNA樣品的限支持物轉移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物500gNC膜或尼龍膜支持物轉移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術來檢測RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測的分子是RNA，可用來對組織或細胞中的mRNA進行定性或定量分析。9/2/202313（二）Northern印跡雜交利用類似于SouthNorthern與Southernblotting的異同點相同點：原理均為毛細作用用途：檢測組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平；比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。不同點：轉移的是RNA轉移前無需酶切轉移效率較高變性方法:DNA(堿變性）

RNA（甲醛、乙二醛等）9/2/202314Northern與Southernblotting的異同④HRP/AP標記抗體與Dig結合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP⑤底物與抗體-HRP/AP反應,顯色或發光底物①

電泳,轉膜，紫外交聯固定D││D

North-South雜交原理和操作流程(地高辛標記)③雜交：Dig標記的探針與靶DNA結合9/2/202315④HRP/AP標記抗體與Dig結合②漂洗和封閉YHRPHRP

North-South雜交原理和操作流程(Biotin標記)③雜交：生物素標記探針與靶DNA結合⑤底物在HRP催化下,反應發光①電泳,轉膜，紫外交聯固定SAHRP底物B││B④HRP標記的鏈親和素與探針上的生物素結合9/2/202316②漂洗和封閉North-South雜交原理和操作流程(Biotin標1.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標記，

保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上X光片，曝光1-5

分鐘；2.顯影：取出X光片，按使用說明書顯影和定影。后繼的化學發光檢測

Luminol化學發光原理9/2/2023171.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標記，2.顯影：取（三）其他核酸雜交方法1.斑點印跡雜交2.原位雜交（insituhybridization）

將變性的DNA或RNA直接點樣于NC膜或尼龍膜上，故稱為斑點印跡。簡便、快速，可以在同一張膜上進行多個樣品的檢測。

是指直接用組織切片或細胞涂片進行雜交的方法，可用于檢測組織切片或細胞內某些特異性核苷酸或核酸片段。9/2/202318（三）其他核酸雜交方法1.斑點印跡雜交2.原位雜交（in二、蛋白質印跡技術(Westernblotting)

根據蛋白質分子之間存在相互作用的特點，將蛋白質電泳分離，然后將其轉移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應的蛋白質分子（最常用的是抗體）對其進行檢測。因此，被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術。

用Westernblotting檢測樣品中存在特異蛋白質用于細胞中特異蛋白質的定量分析用于蛋白質分子的相互作用研究9/2/202319二、蛋白質印跡技術(Westernblotting)9/2/2023208/3/202320③HRP/AP標記抗體與蛋白結合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP④底物與抗體-HRP/AP反應,顯色或發光底物①電泳分離,轉膜,固定蛋白于膜上1.WesternBlotting直接法操作流程:9/2/202321③HRP/AP標記抗體與蛋白結合②漂洗和封閉YHRPHRPH優點：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應引起的非特異性條帶缺點：1.免疫反應性較低2.無信號二級放大3.抗體標記費時昂貴,使用不方便9/2/202322優點：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反④HRP/AP標記二抗與一抗－蛋白復合物結合②漂洗和封閉YYHRPHRPHRP⑤底物與二抗-HRP/AP反應,顯色或發光底物①電泳分離,轉膜,固定蛋白于膜上③一抗與蛋白結合(小鼠單抗或兔多抗)2.WesternBlotting間接法操作流程:9/2/202323④HRP/AP標記二抗與一抗－蛋白復合物結合②漂洗和封閉YY缺點：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反應引起的非特異性條帶優點：1.免疫反應性較高2.有信號二級放大，靈敏度高3.可選用的標記二抗體商品多,使用方便9/2/202324缺點：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反

三種印跡技術的比較

Southernblotting

NorthernblottingWesternblotting樣品限制性內切酶消化電泳變性轉移膜紫外交聯儀等固定雜交標記物DNARNA蛋白質需要不需要不需要瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳SDS電泳堿變性甲醛或戊二醛變性高溫變性NC膜或尼龍膜NC膜或尼龍膜NC膜或PVDF膜需要需要不需要標記探針標記探針 (標記)抗體9/2/202325三種印跡技術的比較Southernblot第二節PCR技術的原理與應用PolymeraseChainReaction9/2/202326第二節PCR技術的原理與應用8/3/2023265

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、PCR技術的基本原理9/2/2023275Primer15Primer2Cycle2CycCycle35

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25～30次循環后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。9/2/202328Cycle35555555555模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶

(Taq

DNA聚合酶)dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分9/2/202329一、PCR技術的基本原理模板DNAPCR體系基本組成成分8/3/202329一PCR反應循環變性95?C左右延伸酶最適溫度72℃退火Tm-5?C55℃

經過30個左右的循環后，PCR的擴增倍數為(1+x)n,x=75%,n為循環數.PCR反應循環變性延伸退火經過30個左右的循環后，P二、PCR技術的主要特點1.特異性強2.靈敏度高3.簡便快速4.對標本的純度要求低9/2/202331二、PCR技術的主要特點1.特異性強2.靈敏度高9/2/202332（三）基因突變分析PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測定學習要求2（二）基因的體外定點突變--PCR定點誘變三、PCR技術的主要用途（一）目的基因的擴增與克隆8/3/202332（三）基因突變分析（四）DNA和R2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段。3.利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定同源性的基因片段。4.利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機克隆基因。1.與反轉錄反應相結合，直接從組織和細胞的mRNA獲得目的基因片段。9/2/202333（一）目的基因的擴增與克隆2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和B’作PCR（二）基因的體外定點突變--PCR定點誘變引物B引物B’5’5’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR5’5’3’3’5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’5’3’3TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"9/2/202335TheNobelPrizeinChemistry1電泳負極正極

測序反應

GATC（五）末端合成終止法測定DNA序列的原理*2’，3’雙脫氧核苷酸*用4種不同熒光標記

DNA樣品、引物DNA聚合酶、dNTPddGddAddTddC5'

3'

CCGATTCTTGCACCTGAGGCTAAAAACGTGGACTGGCTAAAddAAddAGGCTAAAAAddCGGCTAAAAACddGGGCTAAAAACGddTGGCTAAAAACGTddGGGCTAAAAACGTGddGGGCTAAAAACGTGGddAGGCTAAAAACGTGGAddCGGCTAAAAACGTGGACddTGGCTAAA電泳負極正極測序反應GATC（五）末端合成終止法測定DDNA自動測序結果9/2/202337DNA自動測序結果8/3/202337TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBerg1/2oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USA1926-WalterGilbertFrederickSanger1/4oftheprize1/4oftheprize

HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1932-1918-TheNobelPrizeinChemistry1彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(insituPCR)（三）實時PCR技術

(real-timePCR)通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。9/2/202339（一）反轉錄PCR技術(RT-PCR)

四、幾種重要的PCR衍生技術

是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的實時熒光定量PCR

PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監測系統可接收到熒光信號；每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。9/2/202340實時熒光定量PCRPCR擴增時，Taq酶的5’-3第三節

轉基因技術與基因剔除技術

TransgenicTechnology&Gene

KnockoutTechnology9/2/202341第三節

轉基因技術與基因剔除技術

TransgenicT

是指將外源基因整合到動物或植物細胞的基因組中，并使外源基因在動物細胞或植物細胞中穩定地遺傳和表達的技術。基因的導入方式主要：

顯微注射法(最常用)胚胎干細胞法逆轉錄病毒感染法9/2/202342一、轉基因技術是指將外源基因整合到動物或植物細胞的基因組中，并使外轉基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級小鼠”基本原理

是采用顯微注射等方法，將目的基因導入受精卵或著床前的胚胎干細胞核內，并經同源重組整合到的基因組DNA中，然后將細胞置入受體動物子宮，使之發育成個體。

轉基因(transgene)：被導入的目的基因轉基因動物(transgenicanimal)：目的基因的受體動物轉基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter基本乳腺生物反應器的誕生

據推測，2010年世界上采用動物乳腺生物反應器生產的年產超過了500億美元。

1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動子構成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達tPA的轉基因小鼠。乳腺生物反應器的誕生據推測，2010年世界上采用動物動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復,治療風濕性關節炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關節炎牛人血清白蛋白維護血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治

是用顯微操作、電融合等方法，將供體動物體細胞的胞核，全部導入另一動物個體的去核卵細胞中，然后將其置入受體動物子宮，使之發育成為動物個體的技術員。9/2/202346二、核轉移技術--即體細胞克隆技術

核轉移技術產生的個體所攜帶的遺傳物質，與細胞核供體的遺傳物質完全一樣，是一種無性繁殖過程，即克隆(clone)。是用顯微操作、電融合等方法，將供體動物體細胞的胞核，1997年2月27日Nature雜志報道：科學家維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)，利用克隆技術，培育出一只小母羊“多利”。克隆技術被《科學》評為1997年世界十大科技進步之首。“多利”誕生標志著生物技術新時代的來臨1.用于動物克隆－－轉移的核末經修飾1997年2月27日Nature雜志報道：科學家維爾穆特(W核轉移技術的基本原理1.將供者細胞核注入到去核卵細胞內2.用電轉移法將供者細胞核注射到去核卵細胞內核轉移技術的基本原理1.將供者細胞核注入到去核卵細胞內2.1997年6月維爾穆特(Wilmut)報道：用基因改造過的胎兒成纖維細胞為核供體，獲得了表達人凝血因子IX的轉基因克隆綿羊“波莉”。克隆出攜帶有人凝血因子ＩX基因的綿羊早期胚胎成纖維細胞。以該細胞系為核供體移植到去核卵母細胞中，經過處理后將卵母細胞植入假孕綿羊體內發育。獲得3只能高水平表達人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的綿羊。2.用于轉基因動物生物反應器的制備

－－轉移經過修飾的核1997年6月維爾穆特(Wilmut)報道：用基因改造過的胎－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：

通過DNA定點同源重組，使動物胚胎干細胞(ES細胞)的某特定內源基因被破壞而造成其功能喪失。9/2/202350三、基因剔除技術(geneknock-out)是采用分子生物學的方法，定向敲除動物體細胞內的某個基因的技術。－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：基本過程包括：①用同源基因片段構建含有失活目的基因的載體；②顯微注射法將含有失活目的基因的載體導入ES細胞，與ES細胞染色體的相應基因發生同源重組，替代(剔除)掉ES細胞中原有的正常/異常基因；④將含有基因剔除的ES細胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮中，使之發育成一種既含基因剔除細胞又含正常細胞的嵌合體小鼠；⑤將嵌合體小鼠與正常小鼠交配，最終篩選出基因剔除的純合子小鼠。③將剔除正常基因的ES細胞注入動物的囊胚中，使其與囊胚中的細胞共同組成囊胚內的細胞團；基本過程包括：①用同源基因片段構建含有失活目的基因的載體；四、基因轉移和基因剔除在醫學中的應用（一）建立疾病動物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產可用于人體器官移植的

動物器官9/2/202352建立人類疾病的各種動物模型，研究基因在動物體內的表達調控規律及其產物與疾病的關系。轉基因動植物作為醫用或食用蛋白的生物反應器，用于生產出具有醫藥價值的多肽或蛋白質、抗體、疫苗等。學習要求4四、基因轉移和基因剔除在醫學中的應用（一）建立疾病動物模型第四節

生物芯片技術

BiochipTechnology9/2/202353第四節

生物芯片技術

BiochipTechn生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片和組織芯片等。9/2/202354是指采用微電子和微加工技術，將大量已知序列的核酸或蛋白質片段等，有序地組合在約1cm2大小的固相介質表面而構成的集成分析系統。

將其與標記樣品中的特異核酸或蛋白分子雜交、結合，通過對“標記”的測定即可實現對核酸或蛋白質組分的快速、高效的分析處理。生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)或cDNA芯片(cDNAchip)一、基因芯片(genechip)9/2/202355指以原位合成或顯微打印的方式，將大量特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規律地緊密排列、固化在約1cm2的支持物上。

使用時與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析從而得出樣品的遺傳信息。DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNA9/2/202356

玻片型這種芯片的點陣是通過原位合成技術制作的，10~40萬點陣/cm2，必須借助于特殊的儀器對測定結果進行解讀和分析。(Affimetrix公司)。8/3/202356玻片型這種芯片的點陣是通過原位合成2202芯片點樣儀

2202芯片點樣儀

*Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組。*紅色表示上調；黃色表示不變；綠色表示下調。*Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組。是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點陣。加入待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質芯片(proteinchip)9/2/202359基本原理：蛋白質與蛋白質分子之間在空間構象上能特異性的相互識別和相互結合。最常用的探針：抗體檢測方法：標記檢測法、直接檢測法——又稱蛋白質陣列(proteinarray)學習要求5是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點陣第五節

蛋白質相互作用研究技術

Protein-ProteinInteractionTechnology9/2/202360第五節

蛋白質相互作用研究技術

Protein-Prot

該系統的建立是基于對酵母轉錄因子GAL4分子的研究。GAL4（一）基本原理DNA結構域(BD)(DNAbindingdomain)N端轉錄激活域(AD)(activationdomain)C端一、酵母雙雜交系統（yeasttwo-hybridsystem）9/2/202361該系統的建立是基于對酵母轉錄因子GAL4分子的研BD能識別位于Gal4效應基因的上游激活序列(UAS)；GAL4的DNA-BD和DNA-AD結構域：9/2/202362AD可與其他成分結合而啟動UAS下游的基因轉錄。BD和AD兩結構域單獨存在時無轉錄激活功能；只有兩者連接而形成的空間結構才具有轉錄激活功能。BDAD轉錄因子激活序列(UAS)Gal4效應基因BD能識別位于Gal4效應基因的上游激活序列(UAS)；GA9/2/202363將BD基因與已知蛋白基因X融合后，插入表達載體中構建BD-X重組載體；將AD基因與未知蛋白群基因Y(或未知蛋白群cDNA文庫)融合后，插入表達載體構建AD-Y重組載體群。

宿主菌:剔除了轉錄因子GAL4；在其GAL4基因啟動激活序列的下游插入特定的報告基因，如

-半乳糖苷酶編碼基因，表達產物為

-半乳糖苷酶。BDAD轉錄因子激活序列(UAS)Gal4效應基因BDXADYY=Y1,Y2,Y3,,Yn8/3/202363將BD基因與已知蛋白基因X融合后

-半乳糖苷酶YmX

-半乳糖苷酶Ym+iX-半乳糖苷酶YmX-半乳糖苷酶Ym+iX（二）酵母雙雜交系統的應用1.分析已知蛋白質之間的相互作用2.篩選和發現新的相關蛋白質3.篩選藥物的作用位點及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

4.繪制蛋白相互作用系統圖譜9/2/202365（二）酵母雙雜交系統的應用1.分析已知蛋白質之間的相互作二、噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽，與噬菌體表面蛋白融合表達，并呈現在噬菌體表面的技術。通過與特定的標記抗體(或受體、配基等)結合，可把展示有特定蛋白的噬菌體，從表達有各種外源性蛋白的噬菌體肽庫中篩選出來；感染大腸桿菌擴增選出的噬菌體，分離出融合基因并測序，可獲得相應的結構與功能的信息。二、噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽，與噬菌體表三、蛋白質工程中的定點誘變技術是在編碼蛋白質基因的特定位置引入堿基替代、產生堿基缺失或插入，使其編碼的蛋白質的一級結構發生改變。在合成PCR引物時，除了在定點誘變的位置引入相應的突變（點突變、小片段插入或缺失）外，其余序列與模板完全配對

PCR擴增后，產物中就引入特定的突變；將PCR產物克隆表達，可獲得定點突變的蛋白質。PCR誘變：9/2/202367學習要求6三、蛋白質工程中的定點誘變技術是在編碼蛋白質基因第六節

蛋白質與核酸相互作用研究技術

Protein-NucleicAcidInteractionTechnology9/2/202368第六節

蛋白質與核酸相互作用研究技術

Protein