食品微生物學劉書亮微生物的遺傳變異與菌種選育第五章食品微生物學劉書亮了解微生物遺傳變異的物質基礎。掌握基因突變的實質、類型、特點和機制。了解不同類型微生物的基因重組。學會依據微生物的遺傳特性設計工業微生物菌種的篩選程序，并能合理保藏所得菌種。目的要求食品微生物學劉書亮主要內容1、微生物遺傳變異的物質基礎2、微生物的基因突變3、微生物的基因重組4、微生物的菌種選育5、微生物菌種保藏及復壯遺傳（heredity

）:上一代生物將自身的一整套遺傳基因穩定地傳遞給下一代的特性。變異（variation）：生物體在某種外因或內因的作用下，發生遺傳物質結構或數量的改變，而且這種改變穩定，具有可遺傳性。幾個概念1.

遺傳與變異遺傳保證了微生物種的相對穩定性、種的存在和延續，而變異則推動了種的進化和發展。2.

遺傳型和表型遺傳型（genotype）表型(phenotype)某一生物體個體所含有的全部遺傳因子，即基因的總和，又稱為基因型。某一生物體所具有的一切外表特征及內在特性的總和。遺傳型表型環境條件＋代謝、發育飾變（modification）表型的差異只與環境有關。不涉及遺傳物質結構改變而只發生在轉錄、轉譯水平上的表型改變。谷氨酸發酵的溫度敏感菌株在30℃時菌體生長而不產生氨基酸，但是當溫度提高到37℃時，菌體大量合成谷氨酸。變異遺傳物質改變，導致表型改變3.

飾變與變異（遺傳型變異,基因突變）特點：遺傳性、群體中極少數個體的行為（自發突變頻率通常為10-6-10-9）特點：暫時性、不可遺傳性、表現為全部個體的行為。食品微生物學劉書亮比表面積大；

個體易變異；

便于建立純系；作為遺傳研究材料4、微生物是遺傳學研究中的明星：一、證明核酸是遺傳物質基礎的三個經典實驗二、遺傳物質在細胞內存在部位和方式5.1微生物遺傳變異肺的炎雙物球質菌轉基化礎實驗（講）噬菌體的感染實驗病毒重建實驗食品微生物學劉書亮1928年F.Griffith，1944年Avery，肺炎雙球菌的轉化實驗分別用降解DNA、RNA、蛋白質的酶作用于有毒的S型菌細胞抽提物只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉化活性DNA是轉化所必需的轉化因子食品微生物學劉書亮1952年Hershey，Chase，噬菌體感染實驗T2噬菌體感染試驗示意圖植物病毒的重建實驗證明雜種病毒的蛋白質外殼來自TMV還是HRV,可用血清學反應鑒定證明核酸（RNA）是遺傳的物質基礎血清學反應說明病毒蛋白質的特性由核酸而定H.Fraenkel-Conrat

(1956年)病斑的特性和病毒核酸一致二、遺傳物質在細胞內存在的部位和方式（一）七個水平細胞水平（單核，多核）細胞核水平

（真核，擬核，質粒）染色體水平核酸水平基因水平（DNA，部分病毒為RNA；雙鏈，少數病毒為單鏈）（遺傳功能單位）密碼子水平（遺傳信息單位）核苷酸水平（最低突變單位和交換單位）（一套，兩套）基因（gene）是什么?是實體，其物質基礎是DNA

（或RNA）；是一個含有特定遺傳信息的DNA分子區段；是遺傳信息傳遞和性狀分化發育的依據；基因是可分的，根據功能不同，分為：編碼蛋白質的基因無翻譯產物的基因不轉錄的DNA區段結構基因（結構蛋白，酶）調節基因（阻遏蛋白或激活蛋白）tRNA基因（簡稱tDNA

）

rRNA基因（簡稱rDNA

）啟動子（promotor）操縱基因（operator）基因是一個含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳的功能單位。質粒（plas一種獨胞質遺傳因進行自主復制的細種微生物細胞中。質粒和轉座因子mid）：立于染色體外，能子，主要存在于各位于染色體或質粒上的一段能改變自身位置的DNA序列，廣泛分布于原核和真核細胞中。質粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；轉座因子（transposable

element）：原核生物的質粒性質：自主復制；轉移性；質粒的不親和性；質?？上?；包括插入序列IS、轉座子Tn和某些特殊病毒Mu。質粒的主要類型根據質粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應分類:致育因子（Fertility

factor，F因子）抗性質粒（Resistance

factor，R因子）產細菌素的質粒（Bacteriocin

production

plasmid毒性質粒（virulence

plasmid）代謝質粒（Metabolic

plasmid）隱秘質粒（cryptic

plasmid）2μm質粒根據拷貝數或復制特點，質?？煞譃椋焊呖截悢?high

copy

number)質粒（每個細胞中可以有10~100個拷貝,其復制和染色體的復制不同步）如ColE1、ColE2等———————松弛型質粒(relaxed

plasmid)低拷貝數(low

copynumber)質粒（每個細胞中只有1~2個拷貝,其復制行為與染色體的復制同步）如F因子，R100———————嚴謹型質粒(stringent

plasmid)窄宿主范圍質粒(narrow

host

range

plasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復制）廣宿主范圍質粒(broad

host

range

plasmid)（可以在許多種細菌中復制）食品微生物學劉書亮5.2微生物的基因突變1、突變的類型2、突變的特點3、突變的機制野生型:------從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株（wild

typestrain），簡稱野生型。突變株:-----野生型經突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱為突變株（mutant）。食品微生物學劉書亮染色體畸變：是指染色體較大范圍內結構的變化，如缺失、重復、倒位、易位等以及染色體數目的變化。1、突變的類型突變：指遺傳物質突然發生穩定的可遺傳的變化，影響生物正常遺傳的表型和性能的現象。1）突變涉及的范圍，可分為:基因(點)突變：是指一個基因內部遺傳結構或DNA序列的任何改變，涉及一對或少數幾對堿基的置換、缺失或插入堿基置換：各種類型的轉換和顛換移碼突變：堿基對的增減則造成增減變異點以后全部密碼及其編碼的氨基酸改變。同種堿基的置換不同種堿基的置換？？食品微生物學劉書亮★營養缺陷突變型：抗性突變型：★抗藥、紫外線、噬菌體；★條件致死突變型：形態突變型：抗原突變型：產量突變型：2）突變的表型可分為：（1）營養缺陷型（auxotroph）一種缺乏合成其生存所必須的營養物（包括氨基酸、維生素、堿基等）的突變型，只有從周圍環境或培養基中獲得這些營養或其前體物（precursor）才能生長。營養缺陷型是微生物遺傳學研究中重要的選擇標記和育種的重要手段表型判斷的標準：在基本培養基上能否生長特點：在選擇培養基（一般為基本培養基）上不生長負選擇標記突變株不能通過選擇平板直接獲得營養缺陷型的表示方法：基因型：所需營養物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。（2）抗藥性突變型（resistant

mutant）使菌株對某種或某幾種藥物（如抗生素），產生抗性。特點：正選擇標記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示strr

和strs

分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性（3）條件致死突變型（conditional

lethal

mutant）203在某一條件下具有致死效應，而在另一條件下沒有致死效應的突變型。常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts（temperature

sensitive）表示，這類突變在高溫下（如42℃）是致死的，但可以在低溫（如25-30℃）下得到這種突變。特點：負選擇標記這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因（4）形態突變型（morphological

mutant）造成形態改變的突變型特點：

非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態特征上進行區分。的篩選舉例：

產蛋白酶缺陷突變株菌落顏色變化乳糖苷酶基因的插與蘭色的非重組子分開。β半形成芽孢缺陷菌株入失活，使重組子菌落為白色而（5）抗原突變型由于突變引起的細胞抗原結構發生變異的類型。細胞壁缺陷變異莢膜、鞭毛成分變異（6）產量突變型通過基因突變而產生的在代謝產物產量上明顯有別于原始菌株的突變。正突變（plusmutant）負突變（minus

mutant）食品微~物學劉書亮3）突變的條件和原因自然突變：在自然條件下微生物發生的基因突變。突變率為10-8個左右。誘發突變：人工理化因素處理微生物引起的突變。物理誘變：化學誘變：復合誘變：定向培育和馴化：自發性非對應性稀有性獨立性可誘變性穩定性可逆性2、基因突變的特點突變性狀與突變原因不對應(如何證明)突變基因的性狀是穩定的誘變劑可提高突變率，10-106倍自發突變幾率低，10-6--10-9不同基因的突變互不影響回復突變證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應關系！三個經典實驗變量實驗（講）、涂布實驗、影印實驗基因突變自發性和非對應性的證明變量實驗（fluctuation

analysis）Salvador

Luria

and

Max

Delbruck（1943）The

Nobel

Prize

in

Physiology

or

Medicine

1969對噬菌體T1敏感的E.coli

對數期培養物，稀釋至103/mL,分裝兩試管，各10

mL與甲管分裝的各小管同時保溫24~36h甲管乙管Newcombe的涂布實驗（1949）在涂布過的一組中，共長出抗性菌落353個，比未經涂布過的（28個菌落）高得多約繁殖了12.3代選用對T1

噬菌體敏感的

E.coli，以相等數目涂布于

12個平板上影印實驗（replica

plating

）Joshua

Lederberg

and

Esther

Lederberg（1952）通過使菌不接觸抗性環境而檢查其抗性菌落的方法J.

Lederberg

is

awarded

the

Noble

Prize

inMedicine

and

Physiology

in

1958食品微生物學劉書亮3、基因突變的機制3.1自發突變的機制3.2誘發突變的機制突變真的與選擇壓力無關嗎？？食品微生物學劉書亮3.1自發突變的機制多因素低劑量的誘變效應：微生物自身代謝產物的誘變效應：咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸；H2O2互變異構效應：正-反的互變：堿基-脫氧核糖鍵旋轉造成。4）環狀突變效應

：向外環出 恢復正常錯配食品微生物學劉書亮ATGC食品微生物學劉書亮食品微生物學劉書亮模板鏈復制鏈模板鏈復制鏈食品微生物學劉書亮3.2誘發突變的機制堿基對的置換移碼突變染色體畸變直接間接該類誘變劑與堿基起化學反應，改變堿基的結構，導致錯配。亞硝酸：G-C

A-T

轉換互變各種烷化劑

：G-C

A-T

互變羥胺：只引起G-C

A-T

轉換（專一性與C起反應）1）堿基置換——1）直接講1次2次烷甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（MMS）化劑

硫酸二乙酯（DES）N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)氮芥、硫芥環氧乙烷NTG：誘變作用強，稱為超強誘變劑（突變率1%）；能誘發鄰近位置的基因同時發生突變，即所謂并發突變。很多烷化劑除了能誘發點突變外，還能誘發染色體畸變。由于染色體畸變常為輻射所誘發，所以這些物質又稱為擬輻射物質。烷化劑作用的主要機理是引起堿基上某些能形成氫鍵的集團發生烷基化。烷化位點主要在鳥嘌呤的N‐7位和腺嘌呤的N‐3位上，烷化后的堿基也像堿基結構類似物一樣能引起堿基配對的錯誤。烷化劑的另一作用是使嘌呤整個地從DNA鏈上脫下來，產生一個缺口，在與缺口相對應的位點上就能配上任何一個堿基，從而引起轉換或顛換。1）堿基置換——2）間接它們在DNA復制中能摻入DNA

分子中，由于其產生異構體的頻引起堿基的一類與正常堿基結構相似的物質，稱為堿基類似物。如：5-BU,

8-NG,

2-AP等。率高，因此發生的A錯-誤T

配對可A-T

A-BUA-TG-BUG-CA-BU加入5-BU

置換。食品微生物學劉書亮食品微生物學劉書亮扁平的三個苯環結構類似于堿基對的化合物，能插入DNA堿基對間，使堿基增加或缺失而造成。吖啶、吖啶黃、吖啶橙，5-氨基吖啶、溴化乙錠。2）移碼突變食品微生物學劉書亮3）染色體畸變紫外線（UV）

、x射線、γ射線等、亞硝酸及烷化劑常用的非電離輻射誘變因子。作用機制：DNA鏈的斷裂、

DNA雙鏈的交聯、嘧啶的水合作用相鄰堿基形成嘧啶二聚體（TT,TC,CC）等。其中最主要的效應是TT的形成(鏈間、鏈內)。影響解鏈——復制與轉錄——死亡影響氫鍵—扭曲變形—堿基配對—突變或死亡食品微生物學劉書亮食品微生物學劉書亮食品微生物學劉書亮紫外損傷的修復系統（研究較詳細）光復活作用（講）切除修復作用重組修復作用緊急呼救（SOS）修復系統食品微生物學劉書亮光復活作用光解酶結合專一識別“T-T”黑暗酶-DNA光解

光照“T-T”拆開，酶再釋放提高誘變率方法：用紫外線照射菌液后，要在紅

燈下操作處理，再于暗室中或用黑布包起來培養。原理光可大大降低經紫外線照射后微生物死亡率的現象?？梢娛称肺⑸飫翆W一種普遍的修復系統。能移去TT和修復大多數引起的DNA扭曲損傷。該修復系統不需要可見光，通過酶切作用移去損傷的堿基（包括損傷位點附近的一些堿基），隨后合成一段正常

DNA鏈。4種酶參與內切核酸酶外切核酸酶

DNA聚合酶

DNA連接酶切除修復（excision

repair，又稱暗修復）食品微生物學劉書亮重組修復一種越過損傷而進行的修復。這種修復不將損傷的堿基除去，而是通過復制后，經染色體交換，使子鏈上的空隙部位不再面對著嘧啶二聚體，而是面對著正常的單鏈，在這種情況下，DNA聚合酶和連接酶便能起作用，把空隙部分進行修復。留在親鏈上的二聚體仍要依靠再一次的切除修復加以除去，或經細胞分裂而稀釋掉。食品微生物學劉書亮這是細胞經誘導產生的一種應急反應.細胞中有許多基因和操縱子受RecA蛋白協同調控和LexA阻遏蛋白的抑制。SOS修復系統是由RecA蛋白誘導的，由于存在較多DNA損傷時，Rec