儀器分析河北工業大學第十一章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）ThermoFisherUltimate3000高效液相色譜儀

流動相為液體的色譜稱為液相色譜。20世紀70年代初，吉丁斯（J.C.Giddings）將氣相色譜速率理論引入到液相色譜，并在速率理論的指導下，對經典液相色譜做了重大改進，發展了高效液相色譜法，目前它已成為現代儀器分析中最重要的分離分析方法之一。11-1概述一、HPLC的特點與經典的液相色譜法相比，HPLC在技術上采用了高效固定相、高壓泵、高靈敏度檢測器，提高了柱效，加快了分析速度，實現了自動化檢測，其主要特點有：（1）高壓為了提高柱效，HPLC固定相顆粒極細，填充十分緊密，載液流經色譜柱時受到的阻力很大，為了較快地通過色譜柱，必須對載液施加15~35MPa、甚至高達50MPa的高壓。（2）高速高效液相色譜配備了高壓輸液設備，且采用短柱，在分析速度上比經典液相色譜法快得多。例如分離氨基酸，用經典色譜法，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，l小時之內即可完成。（3）高效經典液相色譜的柱效為10~100塔板/米，而HPLC由于使用了高效固定相，其柱效可高達104~106塔板/米；同時，計算機技術的引入也使分離操作和數據處理效率大大提高。（4）高靈敏度

HPLC采用了高靈敏度的檢測器，大大提高了檢測靈敏度。如熒光檢測器最小檢測限可低至0.01ng。此外，其進樣量也很少，用μL級的樣品便可進行全分析。（5）應用范圍廣既能分析一般化合物，也能分析沸點高、熱穩定性差和具有生理活性的物質，還能分析離子型化合物和高聚物。此外，還適宜制備高純試劑。

HPLC與其他儀器的聯用是一個重要的發展方向，如HPLC-MS、HPLC-IR、HPLC-NMR等聯用技術。二、HPLC與GC的比較

HPLC與GC的基本概念和理論是基本一致的，但HPLC所用的流動相、固定相、分析對象、儀器設備和操作條件等于GC不同。（1）流動相

GC-載氣，對組分和固定相呈惰性，專門用來載送樣品，只有固定相能與組分分子作用。而HPLC-載液，對組分分子有一定的親和作用，能與固定相爭奪組分分子，因而增大了分離的選擇性。GC載氣的種類少，HPLC載液種類多，并可靈活調節其極性、離子強度或pH值，為選擇最佳分離條件提供方便。（2）固定相

GC分離的選擇性主要是通過選用不同的固定相來實現，所以GC固定相種類繁多，已有數百種。常用的HPLC固定相僅有十幾種，其分離選擇性在很大程度上要通過選用不同的流動相來改變。GC一般是選定一種載氣，然后通過改變固定相及操作參數（柱溫和載氣流速）來優化分離，而HPLC則相反。此外，GC固定相粒徑較大，70~250μm，HPLC固定相粒徑較小，3~30μm，所以HPLC比GC柱效高得多。（3）分析對象

GC的分析對象是在操作溫度下能氣化而不分解的物質，在已知的有機物中，只有20%能用GC分析；HPLC適合于分子量較大、難氣化、不易揮發或熱不穩定物質、離子型化合物、高聚物等，有大約80%有機物能用HPLC進行分離分析。（4）分離溫度

GC一般在高于室溫下分離，最高可達300~400℃；HPLC的分離溫度一般為室溫或略高于室溫。（5）色譜柱

GC柱較長較粗，如填充柱內徑2~6mm，長1~10m，毛細管柱內徑0.1~0.5mm，長10~100m；HPLC柱較短較細，如常規柱長一般為15~30cm，內徑1~6mm。（6）流動相驅動力

GC一般采用高壓載氣，HPLC常采用高壓泵。此外，為了提高分離效能，縮短分析時間，GC常采用程序升溫的辦法，HPLC采用梯度洗脫方式。11-2高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測和記錄系統四大部分組成。其工作過程為：貯液器中的載液經高壓泵輸送到色譜管路中，試樣由進樣器注入流動相，流經色譜柱進行分離，分離后的各組分由檢測器檢測，輸出信號由記錄儀記錄下來，即得到液相色譜圖。高壓輸液系統進樣系統分離系統檢測和記錄系統一、高壓輸液系統1、貯液器貯液器用來貯裝載液，一般由玻璃、不銹鋼或聚四氟乙烯制成，容量為1~2L。貯液器應帶有脫氣裝置，以便有效脫除溶于載液中的氣體，從而避免基線噪聲增大和基線不穩的情況發生。2、高壓泵

HPLC色譜柱柱徑較細，固定相顆粒細小，再加上液體粘度較大，因此柱內阻力較大。因此必須用高壓泵輸送載液，才能達到快速分離的目的。一般要求泵的輸出壓力為15~50MPa。高壓輸液泵根據其排液性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。目前絕大多數高壓液相色譜所采用的是往復式柱塞恒流泵。3、梯度洗脫裝置

梯度洗脫是將兩種或兩種以上不同性質，但可以互溶的溶劑，隨時間改變而按一定比例混合，以連續改變色譜柱中載液的極性、離子強度或pH值等，從而改變被測組分的保留值，提高分離效率，加快分析速度，使樣品中各組分都能在最佳的分離條件下出峰。梯度洗脫特別適合于樣品中組分k值范圍很寬的復雜樣品的分析。內梯度外梯度梯度洗脫和GC中的程序升溫非常類似。相同點：作用相同，都可以改善復雜樣品的分離效果。不同點：GC中的程序升溫是通過程序改變柱溫，使柱溫按一定速率升高；而HPLC中的梯度洗脫是通過改變流動相組成、極性、pH值和離子強度來達到改變k的目的。二、進樣系統1、注射器進樣

與GC相似優點：價格便宜、操作方便。缺點：進樣重現性較差，隔膜墊片使用次數有限，操作壓力不能過高，一般應小于10MPa。2、六通閥進樣六通高壓微量進樣閥可直接用于35~40MPa高壓下的進樣，由于進樣體積由定量管計量，因此進樣量準確，重現性好，目前幾乎取代了注射器進樣。3、自動進樣器

HPLC還可用自動進樣器進行批量進樣，操作者只需將樣品按順序裝入貯樣裝置，計算機可自動按預定程序進樣。該方法適合于大量樣品的分析，節省人力。三、分離系統分離系統包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱管常采用內徑為1~6mm、長度為10~50cm、內壁拋光的不銹鋼直管制成，柱內裝填有高效微粒固定相。色譜柱通常由專門的廠家生產提供。四、檢測系統檢測器的作用是將色譜柱中流出的樣品組分含量隨時間變化的信號轉化為易于測量的電信號。1、紫外檢測器

使用最廣泛的檢測器，其作用原理是基于待測組分對特定波長紫外線的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關系服從光吸收定律。紫外檢測器有固定波長（254nm、280nm）和可變波長（200~800nm）兩類。紫外光度檢測器具有很高的靈敏度，最小檢測濃度可達0.1ng/mL，對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫。局限：不適用于不吸收紫外線的試樣，也不能選用對紫外線吸收強烈的溶劑作載液。為了擴大其應用范圍和提高選擇性，可選用可變波長檢測器。2、蒸發光散射檢測器蒸發光散射檢測器是90年代出現的新型檢測器。這種檢測器是將流出色譜柱的流動相及組分先引入通載氣（常用高純氮）的蒸發室，在蒸發室和漂移加熱管中，流動相蒸發而除去，樣品組分則在蒸發室內形成不揮發的微小顆粒，在漂移管末端，此微粒在強光照射下產生光散射，用光電倍增管檢測到的散射光與組分的量成正比。此檢測器是一種通用型的質量檢測器，對所有固體物質（檢測時）均有幾乎相等的響應，檢測限一般為8～10ng，可用于揮發性低于流動相的任何樣品組分，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度較低，因此特別適用于無紫外吸收的樣品，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸、維生素及甾體類等化合物，是一種正在迅速發展中的檢測器。1-色譜柱；2-噴霧氣體；3-蒸發漂移管；4-樣品液滴；5-激光光源；6-光二極管檢測器7-散射室

圖蒸發光散射檢測器示意圖3、熒光檢測器許多物質，特別是具有對稱共軛結構的有機芳環分子受紫外光激發后，能輻射出比紫外光波長較長的熒光。一般情況下，熒光檢測器比紫外光度檢測器的靈敏度要高2個數量級，但其線性范圍較窄。4、電導檢測器電導檢測器屬于電化學檢測器，是離子色譜法中使用最廣泛的檢測器。其作用原理是根據物質在某些介質中解離后所產生電導變化來測定解離物質含量。5、示差折光檢測器借助連續測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶有試樣的流動相和純流動相的折射率之差，表示試樣在流動相中的濃度。為通用型檢測器，但靈敏度稍低，對載液流速和溫度十分敏感，要求有很好的恒溫裝置。11-3液相色譜速率理論HPLC的基本概念及理論基礎與GC相似，但它們的流動相不同。二者流動相的性質有明顯的差別，液體的擴散系數只有氣體的萬分之一至十萬分之一，液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍左右。這些性質的差別將影響組分在色譜兩相中的擴散和傳質運動，進而明顯地影響色譜的分離分析過程，所以在描述兩種色譜的速率理論時會有所不同。吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyder）等人提出了液相色譜速率理論方程式中：Hed—渦流擴散項

Hid—分子擴散項

Hm—流動相傳質阻力項

Hsp—固定相傳質阻力項1、渦流擴散項每一個符號的含義與GC相同，減小固定相粒度、柱子填充均勻，均有利于提高柱效。2、分子擴散項Cd為填充系數，在一定條件下為常數；Dm為組分在流動相中的擴散系數，它比氣相擴散系數小4~5個數量級，Hid項通常可以忽略不計。3、固定相傳質阻力項Hsp是由試樣分子從流動相進入固定液內進行傳質引起的。由上式可知，傳質過程取決于固定液的液膜厚度df、試樣分子在固定液內的擴散系數Ds、以及與分配比k有關的系數Cs。因此，對由固定相傳質所引起的峰展寬，應從改善傳質，加快溶質分子在固定相上的解吸過程著手加以解決。4、流動相傳質阻力項（1）Hmp

流動相流動區域內的傳質阻力項當流動相流過色譜柱內的填充物時，處于同一橫截面上所有分子的流速并不相同，由于摩擦作用，靠近填充物顆粒的流動相流速比流路中間的稍慢一些，其結果引起板高的變化，導致峰展寬。Hmp與線速度u、固定相粒度dp、以及試樣分子在流動相中的擴散系數Dm、與分配比k和柱填充狀況有關的系數Cm有關。當柱填料填充均勻緊密時，Cm降低。（2）Hsm

流動相滯留區域內的傳質阻力項由于固定相的多孔性，會造成某部分流動相滯留在固定相微孔內停滯不動。流動相中的試樣分子要與固定相進行質量交換，必須先從流動相擴散到滯留區。若固定相的微孔小而深，傳質速度就慢，對峰形擴展影響就大，柱效就低。固定相的粒度愈小，微孔孔徑愈大，傳質速率就愈快，柱效就高。所以改進固定相結構是提高柱效的有效途徑。Csm是一常數，與顆粒微孔中被流動相所占據部分的分數以及分配比k有關。5、提高柱效的方法影響板高的主要因素是傳質阻力項。（1）采用粒度小而均勻、孔穴較淺的固定相擔體，這是提高液相色譜柱柱效最有效的途徑。（2）采用低粘度溶劑作流動相，以減少在柱內的流動阻力。（3）適當降低流動相流速。但流速太低會增大分子擴散項和減慢分析速度。（4）適當提高柱溫，以降低流動相粘度，增大擴散系數。但柱溫過高會降低分離度。在色譜分析過程中，各種因素是互相聯系和互相制約的。上圖為由速率理論方程得到的HPLC（a）和GC（b）的H-u曲線，從圖中可以看出，二者曲線的形狀十分相似，對應某一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效最高點；HPLC的板高極小值比GC的極小值小一個數量級以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；此外，HPLC的板高最低點對應流速比起GC的流速也小一個數量級。11-4高效液相色譜法的分類根據分離機理不同，可將高效液相色譜法分為液-液分配色譜法、液-固吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法。一、液-液分配色譜法1、分離原理流動相和固定相都是液體，互不相溶，有一個明顯的分界面。試樣溶于流動相，進入色譜柱后，試樣中的組分在兩相間進行分配。達到平衡時，各組分的分配服從分配定律。分離順序取決于分配系數K的大小，K大的組分，保留值就大，后出柱。HPLC中，流動相的種類和性質對K也有較大影響。根據固定液和流動相的極性不同，可分為正相液-液色譜和反相液-液色譜。（1）正相色譜—固定液極性>流動相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱固定相：極性，如硅膠、氧化鋁、羥基、氨基或氰基鍵合固定相流動相：非極性基礎溶劑，正己烷、環己烷極性調節劑，洗脫極性較強的溶質，氯仿、四氫呋喃、甲醇、乙醇主要用于分離極性較強的化合物（2）反相色譜—固定液極性<流動相極性固定相：以硅膠為基質，在其表面將各種不同疏水基團通過化學鍵合到硅膠表面的游離羥基上（如在硅膠表面上鍵合C18烷基的非極性固定相，十八烷基硅烷鍵合相，ODS）。流動相：水、甲醇、四氫呋喃。通常用水-甲醇作流動相時，樣品中極性強的組分先流出，隨后是極性較弱的組分。這是目前應用最多最有效的液相色譜法，適于分離芳烴、稠環芳烴及烷烴等非極性或弱極性化合物。2、液-液分配色譜固定相由擔體和固定液組成。早期：固定液機械地涂漬在擔體上。現在：新型化學鍵合固定相。利用特定的化學反應，把各種不同的有機基團以化學鍵的形式連接到擔體表面的游離羥基上而制得的。具備的條件：一是擔體表面具有某種活性官能團（如硅膠表面的硅醇基），二是固定液應有與擔體表面發生化學反應的官能團。優點：化學穩定性和熱穩定性好，固定液不會流失，不變質，選擇性好，有利于梯度洗脫，極大改善了固定相的柱效能和分離性能。由于液相色譜中流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現較大的改變。因此在液-液色譜中，只需幾種極性不同的固定液即可，其中常用的有β,β′-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷和角鯊烷等。3、液-液色譜流動相由洗脫劑和調節劑組成。洗脫劑：將試樣溶解和分離。調節劑：調節洗脫劑的極性和強度，以改變組分在柱中的移動速度和分離狀態。流動相應具有的條件：對試樣有適當的溶解度；與固定相不互溶，不與試樣發生反應；與所用的檢測器相匹配；粘度應較小，以獲得較高柱效；純度高，毒性小，價格便宜，不污染環境和腐蝕機器。流動相與固定相的極性必須有很大差異，才能減小固定相的溶解度，因此要根據固定相的極性來選擇合適的溶劑作流動相，以提高分離效果。4、應用對極性和非極性化合物都能達到滿意的分離效果，鍵合相液-液色譜尤其對同系物有良好的分離性能。二、液-固色譜法茨維特實驗即是液-固色譜法，固定相為固體吸附劑，它是根據各組分在固定相上吸附能力的差異來進行分離的。1、分離原理流動相分子進入色譜柱后，便以單分子層形式占據吸附劑表面的活性中心點。當試樣中組分分子被溶劑帶入色譜柱時，由于吸附劑對溶劑和各組分分子的吸附能力不同，于是各組分分子和溶劑分子在吸附劑表面活性中心發生競爭吸附。如果吸附流動相分子的能力更強，被吸附的組分分子將減少，保留時間短；如果吸附組分分子能力強，被吸附的組分分子將增多，保留時間長。由此可使具有不同吸附能力的組分分子得以分離。2、液-固色譜固定相

極性吸附劑：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。

非極性吸附劑：活性碳。極性吸附劑酸性：硅膠、硅酸鎂分離堿性物質，如脂肪胺和芳香胺堿性：氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等分離酸性物質，如酚、羧酸和吡咯衍射物等3、液-固色譜流動相

溶劑的極性是選擇流動相的重要依據。選擇液-固色譜流動相時，應使其極性與試樣極性一致。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定比例混合后使用，如果樣品中各組分的分配比相差較大，則可采用梯度洗脫。4、應用液固色譜法是基于吸附劑對溶劑和各組分分子吸附能力的不同而完成對各組分的分離，具有不同官能團的有機化合物具有不同的吸附性能。因此液固色譜法可實現對不同類型有機化合物的分離分析。此外，當組分分子結構與吸附劑表面活性中心的幾何結構相適應時，也易被吸附。因此，吸附色譜還適宜于分離幾何異構體。三、離子交換色譜法1、分離原理離子交換色譜法是以離子交換樹脂作為固定相的色譜法。當流動相帶著組分離解生成的離子通過固定相時，樹脂上具有的可交換的離子基團與具有同號電荷的組分離子進行可逆交換，達到交換平衡。陰陽離子的交換平衡可表示為：陰離子交換：陽離子交換：由于不同物質在溶劑中解離后，對離子交換中心具有不同的親和力，因此具有不同的平衡常數。平衡常數K值越大，表示組分與離子交換樹脂親和力越強，則該組分在柱中停留時間越長，其保留值也越大；反之，平衡常數K值越小，表示組分與離子交換樹脂親和力越弱，則該組分在柱中停留時間較短，其保留值也較小。由此可見，離子交換色譜是根據組分離子對樹脂親和力的不同而得以分離的。2、離子交換色譜固定相離子交換色譜固定相為離子交換樹脂。（1）薄膜型和表層多孔型交換樹脂

薄膜型樹脂是以薄殼玻璃珠為擔體，在其表面涂一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂。表面多孔型樹脂是在惰性固體核表面上先覆蓋一層微球硅膠，然后用機械的方法或化學鍵合的方法，在微球硅珠上涂上一層很薄的樹脂膜。優點：樹脂不溶脹，機械強度高、耐壓、傳質速度快、柱效高。缺點：交換層較薄、柱容量低，使進樣量受到限制。（2）全多孔型離子交換樹脂

陽離子交換樹脂：離子基荷負電，用于分離陽離子。分為強酸性和弱酸性，如磺酸型-SO3H和羧酸型-COOH。

陰離子交換樹脂：離子基荷正電，用于分離陰離子。分為強堿性和弱堿性，如季銨鹽型-NR3和氨基型-NH2。優點：柱容量高，對溫度的穩定性好。缺點：在水或有機溶劑中發生溶脹，不能承受高壓，傳質速率慢柱效較低。樹脂分類樹脂基質有效pH值范圍色譜分析應用強酸型陽離子交換樹脂磺化聚苯乙烯1~14陽離子分類分離，無機離子，鑭系化合物，維生素B，肽，氨基酸弱酸型陽離子交換樹脂羧酸聚甲醛，丙烯酸酯5~14陽離子分類分離，生物化學分離，過渡性元素，氨基酸，有機堿，抗生素強堿型陰離子交換樹脂季銨聚苯乙烯0~12陰離子分類分離，鹵素，生物堿，維生素B，絡合物，脂肪酸弱堿型陰離子交換樹脂聚胺聚苯乙烯，酚-甲醛0~9各種金屬絡陰離子的分類分離，不同價的陰離子氨基酸，維生素表離子交換樹脂的類型及應用3、離子交換色譜流動相離子交換色譜一般以各種鹽類的緩沖水溶液作流動相，通過調節和改變流動相的pH值、緩沖液的類型（提高用于平衡的反離子）、離子強度以及加入少量有機溶劑、配位劑等方式來改變離子交換劑的選擇性，使待測樣品達到良好的分離效果。4、應用離子交換色譜主要用來分離離子或可離解的化合物，常用于無機離子和生物物質的分離。四、離子色譜法機理：通過分離柱后的樣品再經過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。積分儀計算機貯液器記錄儀泵樣品注入分離柱抑制柱電導池離子色譜流程圖抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜：離子交換分離柱，抑制柱，電導檢測器，流動相為電解質洗脫液。樣品為陰離子（以Br-為例）：流動相為NaOH，樣品通過陰離子交換樹脂，發生離子的交換和洗脫，高濃度OH-影響低濃度Br-的檢測。經抑制柱后，洗脫液（NaOH）已被轉變成電導值很小的水，消除了本底電導的影響，提高了所測陰離子電導的檢測靈敏度。離子交換樹脂：R－OH-+Na+Br-R－Br-+Na+OH-抑制柱：R－H++Na+OH-→R－Na+

+H2O流動相R－H++Na+Br-→R－Na+

+H+Br-試樣交換洗脫離子色譜法是水溶液中陰離子分析的最佳方法。五、空間排阻色譜法

空間排阻色譜法又稱凝膠色譜法：不是根據試樣組分與兩相之間的相互作用力進行分離，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現分離的。固定相:為化學惰性多孔物質—凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大，約為數納米至數百納米。凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC)：流動相為水溶液，適合于水溶性樣品分離凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC)：流動相為有機溶劑，適合于非水溶性樣品分離1、分離原理

當試樣組分進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及凝膠孔孔穴中流過。大的組分分子由于不能進入孔穴而被全部排斥，所以最先流出；小的組分分子由于能滲到所有凝膠孔穴中而形成全滲透，所以最后流出；中等大小的組分分子則可滲透到較大的孔穴中，但受到較小孔穴的排斥，所以介于上述兩種組分之間流出。

排阻色譜法的分離是建立在溶質分子尺寸大小的基礎上的。而分子尺寸一般隨相對分子質量的增大而增大，所以洗脫體積又是試樣組分相對質量的函數。圖中A點所對應的相對分子質量即為凝膠的排斥極限，凡是比A點對應的相對分子質量大的分子，均被排斥在所有膠孔之外，因而以一個單一的譜峰出現。圖中B點所對應的相對分子質量即為凝膠的滲透極限，凡是比B點對應的相對分子質量小的分子都可以完全滲入凝膠孔穴中，因而這些組分也以一個單一的譜峰出現。相對分子質量介于上述兩個極限之間的組分，將按相對分子質量不同先后被洗脫，從而得到分離。2、空間排阻色譜固定相空間排阻色譜法主要用來獲得分散性聚合物的相對分子質量分布情況。在選擇色譜柱固定相時，應使待分離的試樣粒子的相對分子質量落在固定相的分級范圍內。

孔徑大小和分布是空間排阻色譜固定相最重要的參數。（1）軟質凝膠。葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等，適用于水為流動相。具有較高的分離能力和較大的柱容量。但滲透能力差，承受壓力低，只適用于常壓下低流速的分離與分析。（2）半硬質凝膠。目前應用最多。強度高，滲透性好，柱效高，但只適用于非極性有機流動相，流速不能太高，也不宜長期在高溫條件下使用。（3）硬質凝膠。多孔硅膠、多孔玻璃等。骨架堅硬，強度高，滲透性好，無溶脹性，流動相可為水或非水溶劑，適應于較高流速下工作。3、空間排阻色譜流動相在空間排阻色譜中，選擇流動相不是為了控制分離，而僅僅是作為試樣的擔體。所以流動相應能溶解試樣，能浸潤固定相，但不應與試樣或固定相發生任何相互作用，即不存在吸附或分配作用。此外，還要求其粘度和毒性低，沸點要比柱溫高20~50，能與檢測器匹配等。常用的流動相有四氫呋喃、十氫化萘、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。4、應用空間排阻色譜主要用來分離分析高聚物和生物大分子。適宜分離的物質：氣相色譜：在操作溫度下能氣化而不分解的物質。正相色譜：主要用于分離極性較強的化合物。反相色譜：適于分離非極性或弱極性化合物。液固色譜：可實現對不同類型有機化合物的分離分析，還適宜于分離幾何異構體。離子交換色譜：主要用來分離離子或可離解的化合物。離子色譜：水溶液中陰離子分析的最佳方法。空間排阻色譜：用來分離分析高聚物和生物大分子。11-5高效液相色譜分析方法的建立一、了解樣品信息和分析目的樣品信息：大概組成、濃度范圍、組分物理性質、紫外光譜圖分析目的：定性、定量，單組份、多組分分析二、樣品的預處理在HPLC中，對大多數樣品進行分析時，都需經稱重或稀釋。一般要求樣品溶液盡可能與流動相的組成接近，即最好用流動相溶解或稀釋樣品。許多樣品都存在背景干擾，還有些樣品中有損壞色譜柱的成分。通常在分析前，對這些樣品進行預處理，如液液萃取、液固萃取、提取、蒸餾等。三、選擇合適的分析方法HPLC分析中，各種方法都有其自身的特點和應用范圍，應根據分離分析目的，試樣的性質和量多少，現有設備條件等選擇最合適的分離方法。一般可根據試樣的相對分子質量大小、溶解度及分子結構等進行分離方法的初步選擇。相對分子質量方面：對于相對分子質量較低（小于200），揮發性較好，加熱又不易分解的試樣氣相色譜法相對分子質量在200~2000的試樣液-固吸附、液-液分配、離子交換、離子色譜相對分子質量大于2000的試樣空間排阻色譜法對于能溶于水并能離解的試樣離子交換色譜法溶于水而不能離解的試樣或溶于醇類（甲醇、乙醇）的試樣反相液-液色譜法能溶于二氯甲烷或氯仿的試樣正相液-液色譜法能溶于烴類（如苯、異辛烷）的試樣液-固色譜法對于分子尺寸大小有差別的試樣空間排阻色譜法溶解性能方面：對于異構體的分離液-固吸附色譜法具有不同官能團的化合物、同系物的分離液-液分配色譜法酸堿化合物、離子型化合物或能與其相互作用的化合物（如配位體及有機螯合劑）首先考慮離子色譜法，其次是液-液分配色譜法對于高分子聚合物空間排阻色譜法分子結構方面：表色譜選擇分離類型原則四、樣品的檢測

紫外檢測器是HPLC最常用的檢測器，在分析樣品時，應首先了解樣品的紫外譜圖。根據紫外譜圖可以選出最佳檢測波長。紫外檢測器一般只能檢測含有共軛不飽和鍵的化合物。若被測化合物沒有足夠的紫外生色團，應考慮熒光、示差折光、電化學檢測器等。五、HPLC操作中的注意事項（1）流動相要保持流動相清潔，必要時應重新蒸餾或過濾。在流動相進入色譜柱之前應脫氣和過濾，避免堵塞泵內或污染色譜柱的柱頭。（2）樣品的凈化預處