第十五章長期毒性作用及其試驗方法

long-termtoxicityimpact

andtestmethod

2023/6/271長期毒性作用及其試驗方法

第一節基本概念和目的第二節試驗設計原則及方法2023/6/272長期毒性作用及其試驗方法

第一節基本概

念

和

目的2023/6/273長期毒性作用及其試驗方法

長期毒性試驗是指試驗動物連續多日接觸較大劑量的藥物所引起的中毒效應，為觀察這種中毒效應而設計的毒理學試驗稱之為長期(慢性)毒性試驗。一、定義

急性毒性試驗是為觀察和評價急性毒性的有害作用或中毒反應而設計的一種毒理學試驗。研究藥物一次或24小時內多次給予受試藥物后，一定時間內所產生的毒性反應。2023/6/274長期毒性作用及其試驗方法5/20123給

藥

的

期

限

不

同長期毒性試驗與急性毒性試驗的根本差別2023/6/275長期毒性作用及其試驗方法6/20123給

藥

的

期

限

不

同給

藥

的

劑

量

范

圍

不

同長期毒性試驗與急性毒性試驗的根本差別2023/6/276長期毒性作用及其試驗方法

蓄積作用(accumulationaction)

當較長時間連續、反復給藥時，如果給藥的時間間隔和劑量超過機體消除藥物的能力，就會出現藥物進入機體的速度

(或總量)

超過排除的速度(或總量)

的現象，此時藥物就有可能在體內逐漸增加并貯存起來，即蓄積作用。

2023/6/277長期毒性作用及其試驗方法

蓄積作用的表現形式作用量積蓄功能性蓄積2023/6/278長期毒性作用及其試驗方法9/20123給

藥

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期

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不

同給

藥

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劑

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范

圍

不

同觀

察

的

毒

效

應

不

同長期毒性試驗與急性毒性試驗的根本差別2023/6/279長期毒性作用及其試驗方法二、目的與意義2023/6/2710長期毒性作用及其試驗方法1預測受試物可能引起的臨床不良反應2判斷受試物反復給藥的毒性靶器官或組織提示臨床試驗中需重點監測的指標43推測臨床試驗的起始劑量和重復用藥的安全劑量范圍為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考5長期毒性試驗的目的2023/6/2711長期毒性作用及其試驗方法

了解實驗動物能耐受的最大劑量，找出完全無毒的安全界量，這個界量是判斷一個待選新藥是否有進一步開發研究的價值以及能否過渡到臨床試用的重要依據，同時，也可為其它毒性實驗和臨床初始劑量的選擇提供依據。因此長期毒性試驗是臨床前安全性評價的主要內容，它與急性毒性試驗、生殖毒性以及致癌性等毒理學研究有著密切的聯系，是新藥報批臨床時重點審評項目之一，是藥物從藥學研究進入臨床試驗的重要環節。長期毒性試驗的意義2023/6/2712長期毒性作用及其試驗方法第二節試驗

設

計

原

則

及

方

法2023/6/2713長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求基本原則全面、嚴謹、合理整體性隨機、對照、重復2023/6/2714長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求基本原則整體性長期毒性試驗不能與藥效學、藥代動力性和其他毒理學研究割裂，試驗設計應充分考慮其他藥理毒理研究的試驗設計和研究結果。長期毒性試驗的結果應該力求與其他藥理毒理試驗結果互為印證、說明和補充。2023/6/2715長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求總體原則選用兩種實驗動物三個劑量給藥途徑應與臨床擬用途徑相同2023/6/2716長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求總體原則

至少在兩種動物體上進行，兼顧雌雄性別。選用兩種實驗動物2023/6/2717長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求總體原則三個劑量劑量至少分為高、中、低三個檔次。高劑量組應能充分反映藥物的毒性，低劑量組不出現毒性反應。同時設一溶劑(或賦形劑)對照組或已知藥物毒性對照組。2023/6/2718長期毒性作用及其試驗方法一、一般原則和要求總體原則給藥途徑應與臨床擬用途徑相同

口服給藥大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量為每天1~2ml/100g，也可將受試藥物混在飼料或水中給予，但要保證每只動物按規定劑量在一定時間內服入，靜脈注射大鼠時可采用腹腔代替，各劑量組采用等容量不等濃度給藥。特殊情況另作說明。2023/6/2719長期毒性作用及其試驗方法理想動物的標準：對受試物的生物轉化與人體相近；對受試物敏感；已有大量歷史對照數據。二、實驗動物

2023/6/2720長期毒性作用及其試驗方法☆我國藥政部門規定的基本原則是選用兩種動物,一種為嚙齒類，首選大白鼠；另一種為非嚙齒類，首選狗。1.種類及品系二、實驗動物

2023/6/2721長期毒性作用及其試驗方法☆我國藥政部門規定的基本原則是選用兩種動物,一種為嚙齒類，首選大白鼠；另一種為非嚙齒類，首選狗。1.種類及品系二、實驗動物

Wistar大鼠SD大鼠

近親繁殖鼠？雜交鼠？2023/6/2722長期毒性作用及其試驗方法☆我國藥政部門規定的基本原則是選用兩種動物,一種為嚙齒類，首選大白鼠；另一種為非嚙齒類，首選狗。1.種類及品系二、實驗動物

一類新藥：Beagle犬二類新藥：雜種狗

2023/6/2723長期毒性作用及其試驗方法☆我國藥政部門規定的基本原則是選用兩種動物,一種為嚙齒類，首選大白鼠；另一種為非嚙齒類，首選狗。1.種類及品系二、實驗動物

☆在吸入給藥時，猴是首先推薦的動物，因為它在呼吸系統的解剖學和生理學方面比其它動物更接近人類。☆如研究計劃生育用藥，應選擇猴或其他大動物。2023/6/2724長期毒性作用及其試驗方法長期毒性作用及其試驗方法長期毒性作用及其試驗方法

Beagle犬：原產英國，純種小獵兔犬

Beagle犬的特點：體型小,毛短,性情溫和,親人,抗病力強

缺點：價格昂貴2023/6/2727長期毒性作用及其試驗方法2.起始月(周)齡一般選擇較年輕的或正處于生長發育階段的動物。二、實驗動物

2023/6/2728長期毒性作用及其試驗方法2.起始月(周)齡一般選擇較年輕的或正處于生長發育階段的動物。二、實驗動物

長期毒性試驗的給藥期限較長；13原因：年齡較大的動物反應性降低,存在許多發性疾病干擾試驗結果。處于生長發育階段的動物對藥物的毒性反應較敏感；232023/6/2729長期毒性作用及其試驗方法嚙齒類動物最好在斷奶后不久即開始給藥

大鼠起始周齡要求在

6~8周齡；

如果試驗周期超過3個月以上，則將起始周齡降至

5~6周齡。狗的起始月齡為6月齡，一般不超過12月齡；如選用雜種狗，起始年齡可稍大些，但也不能超過5年。二、實驗動物

2.起始月(周)齡2023/6/2730長期毒性作用及其試驗方法起始體重應在體重均值±

20%的范圍內。二、實驗動物

2.起始月(周)齡2023/6/2731長期毒性作用及其試驗方法3.性別及數量

（1）性別二、實驗動物

☆一般來講是兼用兩種性別的動物，每個劑量組中雌雄性別的動物數必須一致。2023/6/2732長期毒性作用及其試驗方法

在特殊情況下如藥物對雄性（或雌性）生殖細胞的毒效應已確知，或者急性試驗已證明藥物對雌雄兩性動物的毒性有明顯差別時，就應主要選用敏感性別的動物進行試驗。二、實驗動物

3.性別及數量

（1）性別2023/6/2733長期毒性作用及其試驗方法超過90天的試驗嚙齒類動物每組至少40只（雌雄各20只）；非嚙齒類每組8~10只（雌雄各4~5只）。90天以內的試驗嚙齒類動物每組至少20只（雌雄各10只）；非嚙齒類每組4~6只（雌雄各2~3只）；二、實驗動物

3.性別及數量

（2）數量2023/6/2734長期毒性作用及其試驗方法超過90天的試驗嚙齒類動物每組至少40只（雌雄各20只）；非嚙齒類每組8-10只（雌雄各4~5只）。90天以內的試驗嚙齒類動物每組至少20只（雌雄各10只）；非嚙齒類每組4~6只（雌雄各2~3只）；二、實驗動物

3.性別及數量

（2）數量《指導原則》：一般大鼠為雌、雄各30只，

Beagle犬或猴各3~6只。2023/6/2735長期毒性作用及其試驗方法4.飼養管理

嚴格控制環境條件，避免不必要的干擾因素是非常重要的。二、實驗動物

2023/6/2736長期毒性作用及其試驗方法酮癥酸中毒室內溫度飼料或飼料配方濕度光照通風條件飲水質量環境因素4.飼養管理二、實驗動物

2023/6/2737長期毒性作用及其試驗方法酮癥酸中毒室內溫度飼料或飼料配方濕度光照通風條件飲水質量環境因素4.飼養管理二、實驗動物

嚙齒類動物適宜溫度為18~27℃。相對濕度為40%~70%。光照宜持續12小時明亮，12小時黑暗。通風條件良好。所用飼料應符合動物的營養標準。雌雄動物應分開飼養，每籠不宜超過5只2023/6/2738長期毒性作用及其試驗方法酮癥酸中毒室內溫度飼料或飼料配方濕度光照通風條件飲水質量環境因素4.飼養管理二、實驗動物

犬單籠飼養，定量喂食。

Beagle狗實驗前至少馴養1~2周;

雜種狗應先檢疫，驅蟲。2023/6/2739長期毒性作用及其試驗方法三、給藥期限

按我國藥政管理部門的要求，長期毒性試驗的給藥期限一般為臨床療程的3~4倍時間。創新藥品試驗周期應不少于90天，超過180天的新藥可以在試驗開始90天后，同時進行I期臨床試驗。2023/6/2740長期毒性作用及其試驗方法我國藥政部門關于一般藥物重復給藥毒性試驗期限的規定

臨床擬用毒性試驗期限給藥時間嚙齒類動物非嚙齒類動物﹤5天

2周

2周﹤2周

1月

1月

2-4周

3月

3月

1-3月

6月

6月

﹥3月

6月

9月

每天給藥最好固定時間。2023/6/2741長期毒性作用及其試驗方法四、劑量水平的選擇

三個劑量組是必不可少的：一個是足以引起明顯的毒性反應的高劑量，但死亡率應控制在20%以內；第二個是不引起毒性作用的低劑量(一般為動物有效劑量或臨床治療量的2~3倍)；為表明毒性作用的量—效關系，在上述兩個劑量之間插入一個(或多個)中間劑量。中劑量按計算

2023/6/2742長期毒性作用及其試驗方法

在選擇合適的劑量時還應考慮到：

①藥物在體內的生物蓄積作用。對于高蓄積性藥物應適當減少其劑量，否則在長期毒性試驗結束時各劑量均有可能出現毒性作用；②藥物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而這些酶又是否易被藥物本身所誘導或抑制。③藥物在消化道中的穩定性。與胃腸道內容物有親和性的藥物，則應酌情增加劑量。

2023/6/2743長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）

根據急性毒性的LD50值決定三個劑量。一般在大鼠3個月長期毒性試驗中，高、中、低三個劑量可分別采用約LD50的1/10、1/50和1/100劑量，狗各劑量組可采用大鼠相應各組的一半劑量。長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法

根據急性毒性試驗所提供的相關信息，如毒性的量—效關系，毒性出現的劑量范圍及敏感動物等，先過渡到7天至21天的短期蓄積性試驗，再將獲得的參數外推于長期毒性試驗。長期毒性作用及其試驗方法急性毒性試驗蓄積毒性試驗和/或7天短期重復給藥試驗90天重復給藥試驗180天或更長期重復給藥試驗長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法（3）藥代動力學法

根據藥代動力學最大有效安全濃度（MCD）大鼠3個月長期毒性試驗時，低、中、高三個劑量可分別采用大鼠的1.0、3.3~6.6和10~20MCD;狗一般可采用大鼠一半左右的劑量。長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法（3）藥代動力學法（MBS法）根據大鼠急性毒性試驗的最大耐受量(MTD)大鼠長期毒性試驗的三個劑量分別為1、1/3及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠一半左右的劑量。（4）最大耐受量法（MTD法）長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法（3）藥代動力學法（MBS法）

根據臨床擬用劑量（3個月長期毒性試驗）大鼠低、中、高三個劑量可分別采用50~100倍、25~50倍和

10~20倍臨床劑量狗可分別采用30~50倍、15~25倍和5~10倍臨床劑量猴可采用與狗相近的劑量或略低于狗的劑量進行試驗（4）最大耐受量法（MTD法）（5）臨床擬用劑量法（ACD法）長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法（3）藥代動力學法（MBS法）

根據人和動物的等效劑量比值，再按一定倍數擴大。（4）最大耐受量法（MTD法）（5）臨床擬用劑量法（ACD法）（6）等效劑量法長期毒性作用及其試驗方法不同動物的劑量折算系數

動物種屬小鼠大鼠豚鼠兔貓猴狗人標準K(劑量折算系數)

1

7

12.3

27.5

29.7

64

124

388體重K(kg體重劑量折算系數)

1

0.71

0.62

0.37

0.30

0.32

0.21

0.11任何R(動物體型系數)

0.059

0.09

0.099

0.093

0.082

0.111

0.104

0.1體重W(標準體重kg)

0.02

0.2

0.4

1.5

2

4

12

70注：有些資料記載的動物體型系數（R）為此表中R值的1000倍，如小鼠R為59，大鼠R為90，這不影響藥物劑量的折算。2023/6/2751長期毒性作用及其試驗方法對于標準體重的動物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·KBKA千克體重劑量（mg/kg）dB＝dB·KBKAKA，KB，RA，RB

值由上表查找2023/6/2752長期毒性作用及其試驗方法對于任何體重的動物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·RB·(WB)2/3RAWA千克體重劑量（mg/kg）dB＝dA·RB·(WB)2/3RAWA式中DB、dB

分別是欲計算的B種動物的每只劑量及公斤體重劑量，DA、dA

分別是已知A種動物的每只劑量及公斤體重劑量，WA、WB

是已知動物體重，RA、RB

是體型系數，可由上表查得。2023/6/2753長期毒性作用及其試驗方法可供參考的具體方法（1）半數致死量法（LD50法）（2）短期蓄積試驗過渡法（3）藥代動力學法（MBS法）（4）最大耐受量法（MTD法）（5）臨床擬用劑量法（ACD法）（6）等效劑量法長期毒性作用及其試驗方法五、限度試驗

我國藥政部門規定，如小鼠急性毒性的口服給藥劑量大于5g/kg，注射給藥劑量大于2g/kg仍未產生毒性反應和死亡，或僅個別動物有毒性反應時，可考慮只做一個高于臨床擬用劑量50倍(狗用30倍)的劑量組。2023/6/2755長期毒性作用及其試驗方法

經濟合作與開發組織(OECD)提出如果一種化合物以1000mg/kg的劑量，按規定期限連續給藥，不產生任何可觀察到的毒性反應，而且根據結構相關藥物的已有資料，估計不會產生毒性的話，就不需要再用三個劑量來進行試驗，除非預期臨床需要更高的劑量。

五、限度試驗2023/6/2756長期毒性作用及其試驗方法六、給藥方法長期毒性試驗的給藥途徑一般應盡量與預期臨床使用的途徑相一致。臨床用藥途徑為靜脈或肌注時，3個月及以上的試驗，由于試驗周期長大鼠給藥有困難，可用腹腔或皮下注射代替。如采用灌胃給藥的方式可將供試藥物制成一種溶液或混懸液，但必須注意給藥容量不應超過1~2ml/100g體重/天。2023/6/2757長期毒性作用及其試驗方法六、給藥方法長期毒性試驗一般均強調每天給藥，每周必須給藥7天。給藥期限長（3個月或以上）的藥物每周至少應給藥6天。2023/6/2758長期毒性作用及其試驗方法七、觀察及測定指標

試驗前，嚙齒類動物至少應進行5天的適應性觀察，非嚙齒類動物至少應馴養觀察1~2周，應對動物進行一般觀察及血液生化學指標的檢測。

試驗期間，至少應每天或每兩天作一次詳細的觀察。

試驗結束時，必須留1/3的動物做恢復期的觀察試驗，其觀察期時間一般不超過28天。2023/6/2759長期毒性作用及其試驗方法（一）日常觀察

1.一般觀察內容

包括對實驗動物被毛、皮膚、眼睛、粘膜、孔道(及其分泌物)、呼吸、循環、自主神經系統、軀體和肢體活動情況以及精神行為進行仔細地觀察；對動物糞便的量、色澤和內含物，散失的食物，飲水瓶中殘余的水以及一切可以反映動物生活情況變化的各種跡象，都必須加以注意。所有出現的癥狀都必須記錄在案。2023/6/2760長期毒性作用及其試驗方法1.一般觀察內容

如果發現動物死亡，必須盡可能快地進行尸體剖檢，以減少組織自溶。將組織置于10%的中性福爾馬林或其它適宜的固定液中。如果尸體剖檢不能立即進行，則必須將動物冷藏起來以延緩組織自溶。（一）日常觀察

2023/6/2761長期毒性作用及其試驗方法1.一般觀察內容

對瀕死的動物也應立即處死作尸體剖檢。（一）日常觀察

尸體剖檢后行組織病理學檢查、評價。2023/6/2762長期毒性作用及其試驗方法2.生長率

（一）日常觀察

2023/6/2763長期毒性作用及其試驗方法3.食耗食耗常用來評價給藥對食欲及食物利用率的影響食耗的計算將加入供食器具中飼料的重量減去剩余的飼料重量再除以給食天數

（一）日常觀察

2023/6/2764長期毒性作用及其試驗方法3.食耗食耗常用來評價給藥對食欲及食物利用率的影響食耗的計算將給藥組和對照組的食耗加以比較，有助于說明藥物是否影響實驗動物的食欲。

（一）日常觀察

2023/6/2765長期毒性作用及其試驗方法3.食耗食耗常用來評價給藥對食欲及食物利用率的影響食耗的計算將給藥組和對照組的食耗加以比較，有助于說明藥物是否影響實驗動物的食欲。

（一）日常觀察

如對食欲有影響，則每日進食量必然減少,體重增長亦受影響,但此時食物利用率并不一定降低

如果不影響食欲,而體重增長卻下降,表明藥物有可能影響食物的吸收或合成代謝,此時食物利用率就必然會有變化2023/6/2766長期毒性作用及其試驗方法（二）測定指標

1.器官重量

涉及的主要器官有：

心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺、腦、

腎上腺、甲狀腺、睪丸、前列腺、子宮等。

目的：確定靶器官2023/6/2767長期毒性作用及其試驗方法２００５年ＳＦＤＡ組織編寫

《藥物研究技術指導原則》規定長期毒性試驗中需稱重并計算臟器系數的器官：腦肝臟腎上腺脾臟附睪子宮心臟腎臟胸腺睪丸卵巢肺臟2023/6/2768長期毒性作用及其試驗方法２００５年ＳＦＤＡ組織編寫

《藥物研究技術指導原則》規定長期毒性試驗中需稱重并計算臟器系數的器官：腦肝臟腎上腺脾臟附睪子宮心臟腎臟胸腺睪丸卵巢肺臟甲狀腺、前列腺2023/6/2769長期毒性作用及其試驗方法長期毒性試驗中進行病理組織學檢查的組織或器官：腦（大腦、小腦、腦干）垂體甲狀腺食管胃肝臟腎臟脾臟氣管主動脈附睪卵巢前列腺坐骨神經眼（眼科檢查發現異常時）＊給藥局部淋巴結脊髓胸腺甲狀旁腺唾液腺小腸和大腸膽囊＊腎上腺胰腺肺心臟睪丸子宮乳腺膀胱視神經＊骨髓注：＊為嚙齒類動物可不進行組織病理學檢查的組織或器官長期毒性作用及其試驗方法1.器官重量

器官重量降低，表示該器官萎縮或發育不良；

器官重量增加提示可能有充血、水腫、增生、肥大、酶誘導變化或新生物等。

將動物處死后取出上述器官，除去附著的組織、除盡余血后立即稱重（注意勿使組織干燥）。（二）測定指標

2023/6/2771長期毒性作用及其試驗方法2.血液學（二）測定指標

常規的血液學參數骨髓涂片1.器官重量

2023/6/2772長期毒性作用及其試驗方法２００５年ＳＦＤＡ組織編寫

《藥物研究技術指導原則》規定血液學指標紅細胞計數紅細胞容積平均紅細胞血紅蛋白網織紅細胞計數血小板計數血紅蛋白平均紅細胞容積平均紅細胞血紅蛋白濃度白細胞計數及分類凝血酶原時間紅細胞壓積2023/6/2773長期毒性作用及其試驗方法

血液學指標觀察時間非嚙齒類動物一般于整個試驗周期中每隔1.5~

2個月采血測定一次各項指標。嚙齒類動物

試驗周期為6個月時，可于試驗中期、試驗末

期以及恢復期分別剖殺部分動物(約1/4、

2/4、1/4)，進行各項檢查；

試驗周期為3個月時，可于試驗未期以及恢復

期分別剖殺部分動物(約2/3、1/3)，取血檢查。（二）測定指標

2023/6/2774長期毒性作用及其試驗方法3.血液生化學