項目四：超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的生產

任務１：ＳＯＤ制備方案的制定

生藥１１２１

２０１１４２３２０１

陳楠

SOD中文名稱：超氧化物歧化酶英文名稱：superoxide

dismutase;SOD

定義：編號：EC1.15.1.1。催化超氧化物自由基O－2和氫離子反應形成過氧化氫和分子氧的酶。應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；酶（二級學科）歷史1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶,開始算起，人們對SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發現這種蛋白，并且發現了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發生歧化反應的性質，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。超氧化物岐化酶（SuperoxideDismutase），簡稱SOD，ECl.15.1.1，它催化如下的反應：

2O2-+2H+→H2O2+O2O2-稱為超氧陰離子自由基，是生物體多種生理反應中自然生成的中間產物。它是活性氧的一種，具有極強的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，它通過上述反應可以把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫。盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但體內的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）會立即將其分解為完全無害的水。這樣，三種酶便組成了一個完整的防氧化鏈條。自由基自由基（FreeRadical）是一類非常活躍的化學物質，是個有不成對（奇數）電子的原子、原子團、分子和離子。其中最重要的是氧自由基，它可聚集在體表、心臟、血管、肝臟和腦細胞中。如果它沉積在血管壁上，會使血管發生纖維性病變，導致動脈管硬化，高血壓，心肌梗塞；沉積在腦細胞時，會引起老年人神經官能不全，導致記憶、智力障礙以及抑郁癥，甚至老年性癡呆等，是造成人類衰老和疾病的元兇。氧自由基⑴無機氧自由基：超氧自由基、羥基自由基⑵有機氧自由基：過氧自由基、烷氧自由基、多元不飽和脂肪酸自由基RUFA、半醌自由基。另外，單線態氧1O2、H2O2、NO2、NO等分子雖然沒有奇數電子，但氧化能力強，因此有人把它們和上述氧自由基放在一起，統稱為活性氧。世界各國對“超氧化物歧化酶”的作用認定美國注冊專利號為（CN1152337A）：用于預防和治療大腦局部出血、潰瘍、消除炎癥、心率失常、浮腫、中毒、風濕、類風濕、風濕性關節炎、放射性損傷、藥物中毒等癥。法國注冊專利號為（CN1167441A）：用于預防和治療特異性腦損傷、非特異性腦損傷而引起的腦功能識別障礙。歐洲注冊專利號為（499621）：用于預防和治療癌癥及術后放、化療帶來的腦損傷，抑制癌細胞再形成或擴散。日本注冊專利號為（4327541，4312533）：用于治療器官移植后的抗免疫反應具有奇效。用于治療大腦局部出血導致神經壞死，防止半身不遂的治療藥物。對人體的作用

抑制心腦血管疾病抗衰老防治自身免疫性疾病肺氣腫輻射病及輻射防護老年性白內障抗氧化預防慢性病抗疲勞消除副作用避免二次傷害化解女性的危機有效降低血脂、膽固醇、血壓抗輻射增強肝腎功能對糖尿病有明顯的恢復作用。

應用領域1.藥物類主要集中在炎癥病患者，尤其治療類風濕關節炎、慢性多發性關節炎、心肌梗塞、心血管病、腫瘤患者以及放射性治療炎癥病患者2.生化制藥作為一種生化酶制劑，廣泛應用于臨床和科研上，可抗衰老，抗腫瘤、調節人體內分泌系統3.化妝品可添加在化妝品中，具有抗氧化抗腐蝕的優良性能。以SOD為主要成份的化妝品風靡世界，引發了化妝品歷史上的一場革命，使人類永葆青春美麗夢想成真4.保健食品、飲料

SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常暢銷。在飲料、糖果、糕點等食品中加入SOD既可利用其抗腐蝕性延長保質期，又可調節人體內分泌系統。劑量與用法

肌注，慢性風濕性關節炎，8mg/次，3～4次/周。關節腔內注射：骨關節炎，2mg/次，每2周1次。深部皮下注射：放射性膀胱炎，4mg/次，在放療后15～30分鐘注射。副作用肌注偶見注射局部疼痛、蕁麻疹、蛋白尿。材料啤酒廢酵母試劑：甲苯、氯仿、憑水乙醇、異丙醇、丙酮、磷酸二氫鉀、ＥＤＴＡ、鄰苯三酚等均為分析純。酵母培養基（％）：麓蓬糖8，蛋白質1，酵母膏1。滅菌條件：１２１℃．３０ｍiｎ提取SOD工藝流程

酵母泥

洗滌

酵母培養基滅菌酵母菌復壯

SOD純化SOD提取實驗過程一、廢酵母的預處理二、酵母的復壯培養三、酵母中SOD的提取——異丙醇法四、SOD純化啤酒廢酵母菌等量無菌冰水混勻80-100目篩離心分離沉淀注入無菌冰水搖勻靜置3～4h傾去上層懸濁液冰水漂洗直到所得上層清液無色無味酵母呈純白色為止一、廢酵母的預處理葡萄糖8%蛋白胨1%酵母膏1%蒸餾水1000ml121℃滅菌20min按30％接種量接入經過洗滌后的酵母恒溫搖床培養28℃140r/min2h二、酵母的復壯培養攪拌120min離心除去菌體SOD粗提液每1g酵母濕細胞中加入9mL異丙醇加入三倍體積的50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.0）浸泡120min抽濾除去溶劑三、酵母中SOD的提取——異丙醇法

SOD粗提液用2mol/LHCl調節pH至5.0加入丙酮攪拌搖勻離心（5000r/min）上清調pH到4.0加入丙酮二次沉淀離心（5000r/min）SOD純化產品SOD的等電點在pH4.0左右，而雜蛋白在pH5．0時沉淀量很多，因此提取時將pH調節到5四、SOD純化注意事項丙酮分級沉淀操作時，宜在4～10℃條件下進行，有利于提高蛋白沉淀效果，保護酶活性。

提取SOD后的酵母殘渣及雜蛋白可考慮加工為飼料或飼料蛋白添加劑，真正達到清潔生產的目的。

為降低成本，異丙醇均可考慮回收濃縮循環使用。

SOD活性測定采用改進的微量鄰苯酚自氧化法。

提取條件的研究1.細胞破壁方法分別對比了甲苯法、乙醇-氯仿法、異丙醇法。異丙醇法得到的SOD酶活最高。2.異丙醇濃度的確定

90%的異丙醇提取得到的酶總活力最高3.最佳提取時間

SOD的釋放量隨著提取時間的增加而增加到一定的數量后，增加量減慢。120min提取量和設備利用率都得到保證。4.最適提取pH的確定

在pH7.0時總酶活最高

5.SOD最佳純化條件的確定

pH為5.0，丙酮的濃度控制在丙酮：粗酶液(v/v)=0.8:1時，雜蛋白沉淀最多，SOD純化最好．SOD酶比活最高。6.不同丙酮濃度對SOD沉淀純化的影響采用丙酮：SOD清液為0.3:1的比例所獲得的SOD沉淀酶比活最高，因此