第十三章液相色譜法第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第十三章液相色譜法一、概述二、柱色譜法三、薄層色譜法第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展二、色譜法的分類三、色譜法的基本原理四、色譜法的特點第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展1、色譜法的出現2、色譜法的發展3、色譜法的現狀和未來第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展1903年Tswett（茨維特）研究植物葉子組成時發明了色譜法固定相：碳酸鈣流動相：石油醚玻璃柱：色譜柱第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展1931年Kuhn等用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,γ-胡蘿卜素等60多種植物色素1941年Martin和Synge建立了液液分配色譜法并提出氣相色譜的設想1952年Martin等發明了氣液色譜法1952年Martin和Synge獲得諾貝爾化學獎1941年Consden等發展了紙色譜。第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法（TLC）得以實際應用，而在1956年Stahl開發出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得到廣泛地應用。1957年Golay開創了開管柱氣相色譜法，習慣上稱為毛細管柱氣相色譜60年代末把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜，出現了高效液相色譜（HPLC）。80年代初毛細管超臨界流體色譜（SFC）得到發展，但在90年代后未得到較廣泛的應用。80年代初由Jorgenson等集前人經驗而發展起來的毛細管電泳（CZE），在90年代得到廣泛的發展和應用。同時集HPLC和CZE優點的毛細管電色譜在90年代后期受到重視。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述一、色譜法的產生及發展1956年VanDeemter等在前人研究的基礎上發展了描述色譜過程的速率理論，1965年Giddings總結和擴展了前人的色譜理論，為色譜的發展奠定了理論基礎。21世紀色譜科學在生命科學等前沿科學領域發揮不可代替的重要作用。第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述二、色譜法的分類一）按兩相所處狀態分類流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述二、色譜法的分類二）按操作的形式分平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述二、色譜法的分類三）按分離原理分分配色譜：利用分配系數的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述三、色譜法的基本原理指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復多次洗脫→被測組分分配系數不同→差速遷移→分離微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的先出來，吸附能力強的組分后第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第一節概述四、色譜法的特點特點：“三高”、“一快”、“一廣”高選擇性——可將性質相似的組分分開高效能——反復多次利用組分性質的差異，產生很好分離效果高靈敏度——10-11～10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾～幾十分鐘完成分離一次可以測多種樣品應用范圍廣——氣體，液體、固體物質，化學衍生化再色譜分離、分析

第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第二節柱色譜法一、液-固吸附柱色譜法二、液-液分配柱色譜法三、離子交換駐色譜法四、凝膠柱色譜法第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法一）吸附作用與吸附平衡二）吸附劑及其選擇三）流動相的選擇第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法一）吸附作用與吸附平衡各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心，利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的吸附能力差異而實現分離。K值越大，越容易被吸附，流出色譜柱越慢K值受吸附劑的活性、組分的性質、流動相性質的影響第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇1、吸附劑的種類及性狀常用吸附劑為多孔、微粒狀物質硅膠氧化鋁聚酰胺第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二）吸附劑及其選擇硅膠結構：內部——硅氧交聯結構→多孔結構表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心特性活性和含水量有關，含水量越高，活性越低，級別越高。物質極性越大，吸附能力越強，不易洗脫吸水→失活→105～110℃烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500℃烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適合分離酸性或中性物質第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇氧化鋁堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質中性氧化鋁pH＞7.5適于分析酸性堿性和中性物質酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質特性：活性也和含水量有關，同硅膠聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力↑強，組分越后出柱適用于天然產物有效成分的分離上第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇2、吸附劑活性測定用柱色譜或薄層色譜測定取六種染料①偶氮苯②對甲氧基偶氮苯③蘇丹黃④蘇丹紅⑤對氨基偶氮苯⑥對羥基偶氮苯都配成0.04%的溶液，溶劑為石油醚：苯為4：1固定相：上述固定相流動相：同溶劑讓六種染料通過色譜住，根據染料在色譜柱上的位置判斷活性第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法三）流動相的選擇1、流動相的極性流動相的極性↑，洗脫能力↑。根據“相似相容”原理，來選擇流動相。極性大的選擇極性大的流動相2、被分離組分的極性官能團的極性大小烷烴＜烯烴＜醚類＜硝基化合物＜酯類＜酮類＜醛類＜硫醇＜胺類＜醇類＜羧酸①不飽和烴中雙鍵越多，極性越大②母體相同，官能團的極性越大或越多，極性越大③空間排列對極性也有影響，一般有分子內氫鍵，被吸附力減弱④同系物中分子量越大，極性越小第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、液-固吸附柱色譜法三）流動相的選擇3、吸附劑的選擇分離極性小的組分，用吸附能力大的吸附劑分離極性大的組分，用吸附能力小的吸附劑三者關系圖示：組分吸附劑流動相極性活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二、液-液分配柱色譜法1、分離原理2、載體3、流動相與固定相第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二、液-液分配柱色譜法一）分離原理利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現分離連續萃取過程第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二、液-液分配柱色譜法一）分離原理正相色譜：流動相的極性比固定相弱反相色譜：流動相的極性比固定相強分配系數K與組分的性質、流動相的性質、固定相的性質以及柱溫有關第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二、液-液分配柱色譜法二）載體三）流動相與固定相要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體流動相→必須與固定相不為互溶（所以洗脫劑必須與固定液飽和）載體→惰性，性質穩定，不與固定相和流動相發生化學反應第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一三、離子交換柱色譜法一）原理二）離子交換樹脂的分類三）離子交換平衡四）離子交換樹脂的性能第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一三、離子交換柱色譜法一）原理分離機制：依據被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現分離交換能力弱的，遷移速度快固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一三、離子交換柱色譜法二）離子交換樹脂的類型離子交換樹脂是一類具有網狀結構的高分子聚合物。性質穩定，與酸、堿、某些有機試劑不反應。常用的是聚苯乙烯型的，以苯乙烯為單體、二乙烯苯為交聯劑陽離子型：在樹脂骨架上引入酸性基團，如磺酸基（-SO3H）、羧基（-COOH）、酚羥基（-OH）

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

陰離子型：在樹脂骨架上引入堿性基團，如季銨基（-N（CH3）3+OH-）、伯胺基（-NH2.H2O）

RN（CH3）3+OH-+X-

＝RN（CH3）3+X-+OH-第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一三、離子交換柱色譜法三）離子交換平衡離子交換反應用下列通式表示

R-B++A+=R-A++B+

R代表固定相，W代表流動相相KA/B↑，對A離子結合牢固，B離子在前，A離子在后。與離子的電荷數、水合離子半徑、流動相性質第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一三、離子交換柱色譜法四）離子交換樹脂的性能1、交聯度指離子交換樹脂中交聯劑的含量。交聯度↑，網狀結構緊密，選擇性好，速度慢陽離子交換樹脂交聯度為8%，陰離子為4%2、交換容量在實驗條件下，每克干樹脂真正參加交換的基團數，可用酸堿滴定法測定。單位為mmol/g一般為1～10mmol/g第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一四、凝膠柱色譜法原理利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現分離固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一四、凝膠柱色譜法滲透平衡Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小與流動相的性質無關第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

總結四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數，狹義分配系數，選擇性系數和滲透系數除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關外，其他三種K值都受組分的性質、流動相的性質、固定相的性質以及柱溫的影響第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第三節薄層色譜法（一）概述（二）定性參數（三）吸附劑的選擇（四）展開劑的選擇（五）薄層板的制備（六）定性與定量分析第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第三節薄層色譜法一、概述1、定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進行色譜分離和分析的方法2、操作過程鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)3、分離機制：吸附、分配，離子交換，空間排阻4、特點：分析快速、靈敏、顯色方便5、應用：藥物雜質檢查、純度測定

第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第三節薄層色譜法二、定性參數1、比