生物技術概論（第三版）宋思揚樓士林主編普通高等教育“十一五”國家級規劃教材配套教學課件1.生物技術總論2.基因工程3.細胞工程4.發酵過程5.酶工程6.蛋白質工程7.生物技術與農業8.生物技術與食品9.生物技術與人類健康10.生物技術與能源11.生物技術與環境12.對生物技術發明創新的保護13.生物技術安全性及其應對措施

1.生物技術總論學習目的了解生物技術的含義、特點以及生物技術的發展史。掌握生物技術的各項技術及其相互關系。認識生物技術的應用領域及其對人類社會發展的影響。生物技術被世界各國視為一項高新技術，它廣泛應用于醫藥衛生、農林牧漁、輕工、食品、化工和能源等領域，促進傳統產業的技術改造和新興產業的形成，對人類社會生活將產生深遠的、革命性的影響。生物技術不完全是一門新興學科，它包括傳統生物技術和現代生物技術兩部分。

生物技術總論

引言1.1生物技術的含義1.1.1生物技術的定義生物技術(biotechnology),有時也稱生物工程(bioengineering)，是指人們以現代生命科學為基礎，結合其他基礎學科的科學原理，采用先進的工程技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。因此，生物技術是一門新興的、綜合性的學科。生物技術總論

1生物技術總論1.1.2生物技術的種類及其相互關系酶工程現代生物技術基因工程發酵工程蛋白質工程細胞工程生物工程下游技術

微生物工程菌發酵工程基因工程蛋白質或酶蛋白質工程或酶工程產品

動、植物個體或細胞細胞工程

優良動、植物品系1.1.2生物技術的種類及其相互關系生物技術總論

1.1生物技術的含義基因工程是維系現代生物技術各個研究領域的橋梁和紐帶化學工程學微電子技術數學研發生產產品

基因工程(geneengineering)

應用人工方法把生物的遺傳物質，通常是脫氧核糖核酸(DNA)分離出來,在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導入某種宿主細胞或個體，從而改變它們的遺傳品性；有時還使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產物(多肽或蛋白質)。也稱DNA重組技術。

生物技術總論

1.1.2生物技術的種類及其相互關系

細胞工程(cellengineering)指以細胞為基本單位，在體外條件下進行培養、繁殖；或人為地使細胞某些生物學特性按人們的意愿發生改變，從而達到改良生物品種和創造新品種；或加速繁育動、植物個體；以獲得某種有用的物質的過程。細胞培養細胞融合細胞重構生物技術總論

1.1.2生物技術的種類及其相互關系

酶工程(enzymeengineering)

利用酶、細胞器或細胞所具有的特異催化功能,或對酶進行修飾改造，并借助生物反應器和工藝過程來生產人類所需產品的一項技術。它包括酶的固定化技術、細胞的固定化技術、酶的修飾改造技術及酶反應器的設計等技術。生物技術總論

1.1.2生物技術的種類及其相互關系

發酵工程(fermentationengineering)

利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝過程特殊等特點，在合適條件下，通過現代化工程技術手段，由微生物的某種特定功能生產出人類所需的產品稱為發酵工程，也稱微生物工程。生物技術總論

1.1.2生物技術的種類及其相互關系

蛋白質工程（proteinengineering）是指在基因工程的基礎上，結合蛋白質結晶學、計算機輔助設計和蛋白質化學等多學科的基礎知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而達到對蛋白質進行修飾、改造、拼接以產生能滿足人類需要的新型蛋白質。生物技術總論

1.1.2生物技術的種類及其相互關系

1.1.3生物技術所涉及的學科

現代生物技術是所有自然科學領域中涵蓋范圍最廣的學科之一。它以包括分子生物學、細胞生物學、微生物學、免疫生物學、人體生理學、動物生理學、植物生理學、微生物生理學、生物化學、生物物理學、遺傳學等幾乎所有生物科學的次級學科為支撐，又結合了諸如化學、化學工程學、數學、微電子技術、計算機科學、信息學等生物學領域之外的尖端基礎學科,從而形成一門多學科互相滲透的綜合性學科。其中又以生命科學領域的重大理論和技術的突破為基礎。

生物技術總論

1.1生物技術的含義生物技術總論

1.1.3生物技術所涉及的學科

生物技術所涉及的行業種類

行業種類經營范圍

疾病治療用于控制人類疾病的醫藥產品及技術,包括抗生素、生物藥品、基因治療、干細胞利用等診斷臨床檢測與診斷，食品、環境與農業檢測農業、林業與園藝新的農作物或動物，肥料，生物農藥食品擴大食品、飲料及營養素的來源環境廢物處理、生物凈化、環境治理能源能源的開采、新能源的開發化學品酶、DNA/RNA及特殊化學品設備由生物技術生產的金屬、生物反應器、計算機芯片及生物技術使用的設備等生物技術總論

1.1.3生物技術所涉及的學科傳統生物技術

現代生物技術1.2生物技術發展簡史生物技術總論

1生物技術總論

1.2.1傳統生物技術的產生傳統生物技術應該說從史前時代起就一直為人們所開發和利用，以造福人類。在石器時代后期，我國人民就會利用谷物造酒，這是最早的發酵技術。◆古老的釀造技術◆巴斯德的發現

生物技術總論

1.2生物技術發展簡史1.2.2現代生物技術的發展理論背景：現代生物技術是以20世紀70年代DNA重組技術的建立為標志的。

◆

1944年Avery等闡明了DNA是遺傳信息的攜帶者

◆

1953年Watson&Crick發現DNA雙螺旋結構開創分子生物學

◆

1961年H.G.Khorana&M.W.Nirenberg破譯了遺傳密碼,揭開了DNA編碼的遺傳信息是如何傳遞給蛋白質這一秘密生物技術總論現代生物技術的誕生1973年加州大學的Cohen等實現了細菌間遺傳物質的人工重組，轉入一個抗藥基因，使大腸桿菌獲得了抗藥性，第一例DNA重組技術成功1.2.2現代生物技術的發展生物技術總論1978年Genetech公司和洛衫磯Hope市醫學中心將具有明顯醫藥實用價值的蛋白質胰島素基因導入到E.coli

中表達成功1980轉基因動物首獲成功，美國人得到轉人生長激素基因的超級鼠1983年美國人和比利時人將外源基因引入植物中，并穩定遺傳1997年第一只克隆羊在英國Rosslyn研究所誕生現代生物技術的誕生1.2.2現代生物技術的發展生物技術總論

生物技術的發展將越來越深刻地影響著世界經濟、軍事和社會發展的進程。

1.3生物技術對經濟社會發展的影響生物技術總論

1生物技術總論1.3.1改善農業生產，解決食品短缺

提高農作物的產量及品質培育抗逆的作物優良品系植物種苗的工廠化生產提高糧食品質生物固氮，減少化肥使用量

發展畜牧業生產動物的大量快速無性繁殖培育動物的優良品系生物技術總論

1.3生物技術對經濟社會發展的影響開發制造貴重的新型藥品疾病的預防和診斷基因治療人類基因組計劃1.3.2提高生命質量，延長人類壽命生物技術總論

1.3生物技術對經濟社會發展的影響

美國生物技術產品銷售及預測（百萬美元）

領域1998年2003年2008年增長率%

人類疾病治療9120161002700011

人類疾病診斷2100310043007

農業4201000230019

特制品390900200018

非醫療檢驗2704006008

合計1230021503620011生物技術總論

1.3.2提高生命質量，延長人類壽命美國工業化生物技術研究與發展基金分布圖

生物技術總論

1.3.2提高生命質量，延長人類壽命

解決能源危機生物能源將是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成為新的替代能源。

保護環境人們可以利用微生物凈化有毒的化合物，降解石油污染，清除有毒氣體和惡臭物質，綜合利用廢水和廢渣，處理有毒金屬，達到凈化環境、保護環境、廢物利用并獲得新的產品的目的。1.3.3解決能源危機、治理環境污染生物技術總論

1.3生物技術對經濟社會發展的影響

制造工業原料

利用微生物在生長過程中積累的代謝產物,生產食品工業原料,種類繁多。

生產貴重金屬

利用微生物的浸礦技術對廢渣礦、貧礦、尾礦、廢礦進行提煉。1.3.4制造工業原料、生產貴重金屬生物技術總論

1.3生物技術對經濟社會發展的影響基因工程對微生物的改造是否會產生某種有致病性的微生物，這些微生物都帶有特殊的致病基因，如果它們從實驗室逸出并且擴散，有可能造成類似鼠疫那樣的可怕疾病的流行。轉基因作物及食品的生產和銷售，是否對人類和環境造成長期的影響，擅自改變植物基因是否可能引起一些難以預料的危險。1.3.5生物技術的安全及其對倫理、道德、法律的影響生物技術總論

1.3生物技術對經濟社會發展的影響分子克隆技術在人類身上的應用可能造成巨大的社會問題，并對人類自身的進化產生影響；而應用在其他生物上同樣具有危險性，因為所創造出的新物種有可能具有極強的破壞力而引發一場浩劫。生物技術的發展將不可避免地推動生物武器的研制與發展，使籠罩在人類頭上的生存陰影越來越大。動物克隆技術的建立，如果被某些人用來制造克隆人、超人，將可能破壞整個人類社會的和平。生物技術總論

1.3.5生物技術的安全及其對倫理、道德、法律的影響復習思考題現代生物技術是一項高技術，它具有高技術的“六高”特征是指哪“六高”？什么是生物技術，它包括哪些基本的內容？它對人類社會將產生怎么樣的影響？為什么說生物技術是一門綜合性的學科，它與其他學科有什么關系？簡要說明生物技術的發展史以及現代生物技術與傳統生物技術的關系。生物技術的應用包括哪些領域？生物技術總論

1生物技術總論主要參考文獻1.顧方舟，盧圣棟.生物技術的現狀與未來.北京：北京醫科大學協和醫科大學聯合出版社.19902．中國生物工程開發中心生物技術領域專家委員會.中國生物技術的崛起——生物技術領域十年發展歷程.（內部刊物）.19963．林綿湖譯.21世紀的生物技術——實現諾言（內部刊物）.19954．朱圣庚等.生物技術.上海：上海科學技術出版社.19955．李亞一等.生物技術——跨世紀技術革命的主角.北京：中國科學技術出版社.19946．王聯結.生物工程概論.北京：中國輕工業出版社.20027．何忠效等.現代生物技術概論.北京：北京師范大學出版社.19998.國家發展和改革委員會高技術產業司，中國生物工程學會.中國生物技術產業發展報告（2003）.北京：化學工業出版社.20039.王宏廣.發展生物技術引領生物經濟.北京：中國醫藥科技出版社.2005

（宋思揚編寫）生物技術總論

1生物技術總論2.基因工程學習目的學習基因工程基本原理和基本操作過程,為進一步學習生物技術相關知識和從事基因工程工作打下基礎。

2.1基因工程概況

2.1.1基因工程的基本含義

按照人們的愿望（人為的），進行嚴密的設計（類似工程設計），通過體外DNA重組（非生命活動過程）和轉基因等技術，有目的地改造生物種性，使現有的物種在較短的時間內趨于完善（區別于自然突變和常規育種），創造出更符合人們需求的新的生物類型;利用這種技術對人類疾病進行有效的診斷和治療。基因工程2基因工程2.1.2基因工程的主要理論依據不同基因具有相同的遺傳物質(DNA/RNA)

基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉移的多肽與基因之間存在對應關系遺傳密碼是通用的(絕少數除外)

可以通過DNA復制把遺傳信息傳遞給下一代基因工程2.1基因工程概況2.1.3基因工程研究的基本技術路線基因工程2.1基因工程概況2.1.4基因工程突出的優點打破了常規育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進行相互重組和轉移可以使動物與植物之間的遺傳信息進行相互重組和轉移可以使人與其他生物間的遺傳信息進行相互重組和轉移基因工程2.1基因工程概況

2.2.1DNA

DNA的組成和結構基因工程2基因工程

DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。

脫氧核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸基組成。

四種脫氧核苷酸的脫氧核糖、磷酸基的結構和位置相同，只是各自的堿基不同。

2.2DNA重組堿基有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種。脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接。多個脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5′-磷酸基(5′-P)稱為5′端；另其一端為游離的3′

-羥基(3′-OH),稱為3’端。基因工程DNA的組成和結構基因工程DNA的組成和結構

DNA的雙螺旋結構

DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補配對和G與C互補配對的，通過氫鍵形成穩定的雙螺旋結構，稱為雙鏈DNA。少數病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的。基因工程DNA的組成和結構B-DNA雙螺旋分子模型基因工程DNA的組成和結構

DNA的功能

（1）DNA分子能在細胞內復制

以原有的DNA鏈為模板，從特定的復制起始位點（ori）起始，復制出新的DNA鏈。

（2）DNA是基因的主要攜帶者

一個基因是DNA分子上的一個特定的核苷酸序列。

基因工程2.2.1DNA基因工程DNA的功能

原核生物基因啟動子相關的保守核苷酸序列

Pribnow框或-10區：

-4~-13bp之間由６個核苷酸組成，多數是TATAAT序列。

-35區：-35bp前后保守的TTGACA序列。動、植物基因啟動子相關的保守核苷酸序列生物類型

TATA區（-25~-30）

CAAT區（-70~-80）

GC區（-80~-100）動物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG基因工程DNA的功能終止子發夾結構序列基因工程DNA的功能

2.2.2獲得DNA片段的主要途徑目的：（1）獲得含有基因的DNA片段（2）獲得含有基因表達調控因子的DNA片段（3）獲得含有與基因重組有關的核苷酸序列的DNA片段主要途徑：（1）限制性內切核酸酶酶切法（2）PCR擴增法（3）化學合成法基因工程2.2DNA重組

限制性內切核酸酶和DNA片段化

限制性內切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列,并在合適的反應條件下,使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開,產生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。

命名：HindIII由Haemophilus

influenzaeRd中屬名的H,種名的in和菌株代號的d組成,III表示從此菌株中提取的第三種限制性內切核酸酶。

識別序列規律：旋轉對稱或左右互補對稱。

切割位點:在識別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置。

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑限制性內切核酸酶識別序列、酶切位點和酶切片段末端基因工程

限制性核酸內切酶和DNA片段化粘性末端：產生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸。3′端比5′端長的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長的稱為5′粘性末端。平末端：產生的DNA片段末端是平齊的。限制性內切核酸酶的切割方法:

單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法環狀DNA酶切片段示意圖基因工程

限制性核酸內切酶和DNA片段化特異性DNA片段的PCR擴增特點：體外高效擴增特異DNA片段。一個待擴增的DNA片段，在3h內可擴增出約106

個這樣的DNA片段。關鍵因子：

※耐熱性DNA聚合酶

※引物

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑反應過程：※

反應系統加熱至90~95℃,底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA；※

降溫至37~60℃,使引物與模板DNA鏈互補序列雜交(復性)；※

升溫至70~75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸,合成模板DNA鏈的互補鏈。※

重復以上過程，一般經過25～30次循環片段。基因工程特異性DNA片段的PCR擴增基因工程特異性DNA片段的PCR擴增

化學合成目的基因

根據待合成的DNA片段預定的核苷酸序列，采用DNA合成儀，將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑DNA合成儀2.2.3DNA片段的連接DNA連接酶（DNAligase）催化機理：催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′-OH末端與5′

-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前常用的連接酶：

E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶。基因工程2.2DNA重組具互補粘性末端片段之間的連接基因工程2.2.3DNA片段的連接DNA片段之間的連接

基因工程DNA片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接DNA片段末端修飾后進行連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段脫磷酸化后連接DNA片段末端修飾后進行連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段加連桿后或加銜接頭連接

基因工程DNA片段之間的連接

DNA重組類型

插入重組置換重組基因工程2.2.3DNA片段的連接基因工程2基因工程

基因克隆載體的含義能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以相對穩定維持的DNA分子稱為基因克隆載體（genecloningvector）。基因克隆載體應具備的基本條件具有1個或多個克隆位點。進入受體細胞后，一般是能夠以不同的形式進行復制。含有供選擇克隆子的標記基因。克隆載體必須是安全的。2.3基因克隆載體克隆載體種類按構建克隆載體的材料來源分:

質粒克隆載體、病毒（噬菌體）克隆載體、線粒體克隆載、人工染色體克隆載體、葉綠體克隆載體......

按克隆載體的用途分:

一般克隆載體、表達載體、建庫載體、T或U載體......

基因工程

2.3基因克隆載體按克隆載體的受體生物分:原核生物克隆載體大腸桿菌克隆載體、放線菌克隆載體......真核生物克隆載體酵母克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體、人克隆載體......

基因工程

2.3基因克隆載體克隆載體種類含義：以質粒DNA分子為基礎構建的克隆載體，必須含有質粒的復制起始位點。種類：大腸桿菌質粒載體藍藻穿梭質粒載體農桿菌Ti質粒載體酵母2μm質粒載體

......2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3基因克隆載體質粒DNA基因工程

2.3.1質粒克隆載體pBR322簡圖基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體含義以病毒（噬菌體）DNA或cDNA為主構建的克隆載體，或者通過轉染直接進入宿主細胞，或者包裝成病毒顆粒后通過轉導進入宿主細胞。種類噬菌體克隆載體：λ噬菌體克隆載體

Cosmid載體植物病毒克隆載體：CaMV克隆載體動物病毒克隆載體：痘苗病毒載體腺病毒載體反轉錄病毒克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3基因克隆載體入噬菌體載體gtwes-λB

基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體痘苗病毒載體示意圖基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

（1）含義：指能在宿主細胞中穩定地復制并準確傳遞給子細胞的人工構建的染色體。（2）特點：能容納長達1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：構建基因組文庫,克隆和轉移完整的高分子量基因,基因功能鑒定,基因治療……

基因工程

2.3基因克隆載體（4）類型：線形的人工染色體：必須含有端粒、著絲粒和復制起始區。包含：酵母人工染色體（YAC)

人類人工染色體（HAC)

哺乳動物人工染色體（MAC)環形的人工染色體：不需要端粒和著絲粒，但必須含有合適的復制起始區。包含：細菌人工染色體(BAC)

源于噬菌體Ｐ1的人工染色體(PAC)

雙元細菌人工染色體(BIBAC)

可轉化人工染色體(TAC)基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）

常規基因整合平臺系統

內源平臺雙交換置換載體內源平臺雙交換插入載體內源平臺單交換插入載體外源平臺雙交換插入載體基因工程

2.3基因克隆載體基因工程

常規基因整合平臺系統loxP位點序列示意圖

基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統基因工程

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）基因工程

基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統2.4.1目的基因來源

目的基因：在基因工程設計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預期表達產物的基因。

目的基因的生物來源:

真核生物染色體基因組

原核生物染色體基因組質粒基因組病毒（噬菌體）基因組

線粒體基因組葉綠體基因組

基因工程2基因工程2.4獲得目的基因2.4.2分離目的基因的途徑

利用限制性內切核酸酶酶切法直接分離目的基因

基因工程2.4獲得目的基因PCR擴增含目的基因DNA示意基因工程2.4.2分離目的基因的途徑

利用PCR直接擴增目的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑

目的基因的化學合成

通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑基因工程

通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因

2.5.1受體細胞

原核生物

種類：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌、棒狀桿菌、放線菌等基因工程2基因工程2.5目的基因導入受體細胞特點：大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入;沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩;

基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養簡單,繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。基因工程

原核生物

真核生物特點：真核生物細胞具備真核基因表達調控以及表達產物加工和分泌等的機制，因此作為受體細胞表達真核基因優于原核生物細胞。

基因工程2.5.1受體細胞真核細胞模式圖種類：

酵母：基因結構相對比較簡單，便于基因工程操作；培養簡單，適于大規模發酵生產，成本低廉；外源基因表達產物能分泌到培養基中,便于產物的提取和加工；不含特異性的病毒，不產生毒素，是安全的受體細胞。植物細胞：具全能性。有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草和擬南芥等。動物細胞：目前多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞以及干細胞。有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。基因工程

真核生物

2.5.2重組DNA分子導入受體細胞

外源DNA轉化方法化合物誘導轉化法根癌農桿菌介導轉化法

電穿孔轉化法

微彈轟擊(基因槍)轉化法

基因工程2基因工程2.5目的基因導入受體細胞激光微束穿孔轉化法

超聲波處理轉化法脂質體介導轉化法

體內注射轉化法花粉管通道轉化法精子介導法低能離子束介導轉化法基因工程

外源DNA轉化方法電穿孔儀

病毒(噬菌體)顆粒轉導法

用病毒(噬菌體)的DNA（或cDNA）構建成重組DNA，在體外包裝成重組病毒(噬菌體)顆粒，通過感染使重組DNA進入受體細胞。

基因工程2.5.2重組DNA分子導入受體細胞方式：重組病毒直接感染受體細胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細胞重組病毒感染互補型受體細胞系適用：主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構建和動植物的轉基因。基因工程

病毒(噬菌體)顆粒轉導法基因工程

病毒(噬菌體)顆粒轉導法2.5.3克隆子的篩選

根據載體標記基因篩選轉化子根據載體抗菌素抗性基因篩選轉化子根據載體除草劑抗性基因篩選轉化子根據LacZ′基因互補顯色篩選轉化子根據生長調節劑非依賴型篩選轉化子根據核苷酸合成代謝相關酶基因缺失互補篩選轉化子基因工程2.5目的基因導入受體細胞

根據報告基因篩選轉化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

螢火蟲熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）

根據形成噬菌斑篩選轉化子

基因工程2.5.3克隆子的篩選2.6.1根據重組DNA分子特征鑒定重組子

根據重組DNA分子大小鑒定重組子

根據重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子

根據PCR擴增片段鑒定重組子基因工程2基因工程2.6重組子的鑒定

采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交斑點印跡雜交菌落（或噬菌斑）原位雜交基因工程2.6.1根據重組DNA分子鑒定重組子基因工程

采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交基因工程

采用DNA分子雜交法鑒定重組子菌落（或噬菌斑）原位雜交基因工程

采用DNA分子雜交法鑒定重組子基因工程2.6.1根據重組DNA分子鑒定重組子

應用ＤＮＡ芯片鑒定重組子基因工程2.6.1根據重組DNA分子鑒定重組子

根據DNA序列鑒定重組子2.6.2根據外源基因轉錄產物mRNA鑒定重組子根據RT-PCR擴增片段鑒定重組子采用RNA分子雜交法鑒定重組子

Northern印跡雜交法斑點印跡雜交菌落（或噬菌斑）原位雜交基因工程2.6重組子的鑒定

2.6.3根據目的基因翻譯產物蛋白質（酶）、多

肽鑒定重組子蛋白質凝膠電泳法鑒定重組子單向凝膠電泳雙向凝膠電泳毛細管等電點凝膠電泳免疫檢測法鑒定重組子

酶聯免疫吸附法

Western印跡法固相放射免疫法免疫沉淀法質譜分析法基因工程2.6重組子的鑒定

酶標儀基因工程2.6.3根據外源基因翻譯產物蛋白質（酶）、多肽鑒定重組子基因工程2.6.3根據外源基因翻譯產物蛋白質（酶）、多肽鑒定重組子

2.7.1基因工程的應用

基因工程藥物轉基因植物

轉基因動物基因工程2基因工程2.7基因工程技術應用與安全性問題

2.7.2基因工程的安全性問題對轉基因生物安全性的爭論應正確認識轉基因生物的利與弊轉基因生物的安全管理基因工程2.7基因工程技術應用與安全性問題轉基因豬基因工程

2基因工程1.基因工程研究的理論依據是什么?2.簡述基因工程研究的基本技術路線。3.簡述限制性內切核酸酶和DNA連接酶的作用機制。4.在什么情況下最好使用質粒載體或λ噬菌體載體或cosmid載體？5.闡述人工染色體作為載體的特點。6.簡述染色體定位整合克隆載體的應用價值7.簡述各種特殊用途克隆載體的特點8.從cDNA文庫和基因組文庫中獲得的目的基因有什么不同？9.如何采用PCR技術從生物材料中分離出目的基因？10.什么樣的細胞可用作受體細胞？11.闡述外源基因轉入受體細胞的各種途徑。12.篩選克隆子有哪些方法？13.闡述基因工程的科學意義、應用價值以及發展前景。復習思考題

基因工程

2基因工程主要參考文獻樓士林，楊盛昌，龍敏南等.2002.基因工程.北京：科學出版社AusubelF等.2005.精編分子生物學實驗指導（原書第四版）.馬學軍，舒躍龍，顏子穎等譯.北京：科學出版社Sambrook

J,RussellD.2001.Molecularcloning-Alaboratorymanual(3rd),NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress

（樓士林編寫）2.基因工程學習目的學習基因工程基本原理和基本操作過程,為進一步學習生物技術相關知識和從事基因工程工作打下基礎。

2.1基因工程概況

2.1.1基因工程的基本含義

按照人們的愿望（人為的），進行嚴密的設計（類似工程設計），通過體外DNA重組（非生命活動過程）和轉基因等技術，有目的地改造生物種性，使現有的物種在較短的時間內趨于完善（區別于自然突變和常規育種），創造出更符合人們需求的新的生物類型;利用這種技術對人類疾病進行有效的診斷和治療。基因工程2基因工程2.1.2基因工程的主要理論依據不同基因具有相同的遺傳物質(DNA/RNA)

基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉移的多肽與基因之間存在對應關系遺傳密碼是通用的(絕少數除外)

可以通過DNA復制把遺傳信息傳遞給下一代基因工程2.1基因工程概況2.1.3基因工程研究的基本技術路線基因工程2.1基因工程概況2.1.4基因工程突出的優點打破了常規育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進行相互重組和轉移可以使動物與植物之間的遺傳信息進行相互重組和轉移可以使人與其他生物間的遺傳信息進行相互重組和轉移基因工程2.1基因工程概況

2.2.1DNA

DNA的組成和結構基因工程2基因工程

DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。

脫氧核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸基組成。

四種脫氧核苷酸的脫氧核糖、磷酸基的結構和位置相同，只是各自的堿基不同。

2.2DNA重組堿基有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種。脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接。多個脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5′-磷酸基(5′-P)稱為5′端；另其一端為游離的3′

-羥基(3′-OH),稱為3’端。基因工程DNA的組成和結構基因工程DNA的組成和結構

DNA的雙螺旋結構

DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補配對和G與C互補配對的，通過氫鍵形成穩定的雙螺旋結構，稱為雙鏈DNA。少數病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的。基因工程DNA的組成和結構B-DNA雙螺旋分子模型基因工程DNA的組成和結構

DNA的功能

（1）DNA分子能在細胞內復制

以原有的DNA鏈為模板，從特定的復制起始位點（ori）起始，復制出新的DNA鏈。

（2）DNA是基因的主要攜帶者

一個基因是DNA分子上的一個特定的核苷酸序列。

基因工程2.2.1DNA基因工程DNA的功能

原核生物基因啟動子相關的保守核苷酸序列

Pribnow框或-10區：

-4~-13bp之間由６個核苷酸組成，多數是TATAAT序列。

-35區：-35bp前后保守的TTGACA序列。動、植物基因啟動子相關的保守核苷酸序列生物類型

TATA區（-25~-30）

CAAT區（-70~-80）

GC區（-80~-100）動物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG基因工程DNA的功能終止子發夾結構序列基因工程DNA的功能

2.2.2獲得DNA片段的主要途徑目的：（1）獲得含有基因的DNA片段（2）獲得含有基因表達調控因子的DNA片段（3）獲得含有與基因重組有關的核苷酸序列的DNA片段主要途徑：（1）限制性內切核酸酶酶切法（2）PCR擴增法（3）化學合成法基因工程2.2DNA重組

限制性內切核酸酶和DNA片段化

限制性內切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列,并在合適的反應條件下,使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開,產生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。

命名：HindIII由Haemophilus

influenzaeRd中屬名的H,種名的in和菌株代號的d組成,III表示從此菌株中提取的第三種限制性內切核酸酶。

識別序列規律：旋轉對稱或左右互補對稱。

切割位點:在識別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置。

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑限制性內切核酸酶識別序列、酶切位點和酶切片段末端基因工程

限制性核酸內切酶和DNA片段化粘性末端：產生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸。3′端比5′端長的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長的稱為5′粘性末端。平末端：產生的DNA片段末端是平齊的。限制性內切核酸酶的切割方法:

單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法環狀DNA酶切片段示意圖基因工程

限制性核酸內切酶和DNA片段化特異性DNA片段的PCR擴增特點：體外高效擴增特異DNA片段。一個待擴增的DNA片段，在3h內可擴增出約106

個這樣的DNA片段。關鍵因子：

※耐熱性DNA聚合酶

※引物

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑反應過程：※

反應系統加熱至90~95℃,底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA；※

降溫至37~60℃,使引物與模板DNA鏈互補序列雜交(復性)；※

升溫至70~75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸,合成模板DNA鏈的互補鏈。※

重復以上過程，一般經過25～30次循環片段。基因工程特異性DNA片段的PCR擴增基因工程特異性DNA片段的PCR擴增

化學合成目的基因

根據待合成的DNA片段預定的核苷酸序列，采用DNA合成儀，將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑DNA合成儀2.2.3DNA片段的連接DNA連接酶（DNAligase）催化機理：催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′-OH末端與5′

-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前常用的連接酶：

E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶。基因工程2.2DNA重組具互補粘性末端片段之間的連接基因工程2.2.3DNA片段的連接DNA片段之間的連接

基因工程DNA片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接DNA片段末端修飾后進行連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段脫磷酸化后連接DNA片段末端修飾后進行連接

基因工程DNA片段之間的連接DNA片段加連桿后或加銜接頭連接

基因工程DNA片段之間的連接

DNA重組類型

插入重組置換重組基因工程2.2.3DNA片段的連接基因工程2基因工程

基因克隆載體的含義能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以相對穩定維持的DNA分子稱為基因克隆載體（genecloningvector）。基因克隆載體應具備的基本條件具有1個或多個克隆位點。進入受體細胞后，一般是能夠以不同的形式進行復制。含有供選擇克隆子的標記基因。克隆載體必須是安全的。2.3基因克隆載體克隆載體種類按構建克隆載體的材料來源分:

質粒克隆載體、病毒（噬菌體）克隆載體、線粒體克隆載、人工染色體克隆載體、葉綠體克隆載體......

按克隆載體的用途分:

一般克隆載體、表達載體、建庫載體、T或U載體......

基因工程

2.3基因克隆載體按克隆載體的受體生物分:原核生物克隆載體大腸桿菌克隆載體、放線菌克隆載體......真核生物克隆載體酵母克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體、人克隆載體......

基因工程

2.3基因克隆載體克隆載體種類含義：以質粒DNA分子為基礎構建的克隆載體，必須含有質粒的復制起始位點。種類：大腸桿菌質粒載體藍藻穿梭質粒載體農桿菌Ti質粒載體酵母2μm質粒載體

......2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3基因克隆載體質粒DNA基因工程

2.3.1質粒克隆載體pBR322簡圖基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體基因工程

2.3.1質粒克隆載體含義以病毒（噬菌體）DNA或cDNA為主構建的克隆載體，或者通過轉染直接進入宿主細胞，或者包裝成病毒顆粒后通過轉導進入宿主細胞。種類噬菌體克隆載體：λ噬菌體克隆載體

Cosmid載體植物病毒克隆載體：CaMV克隆載體動物病毒克隆載體：痘苗病毒載體腺病毒載體反轉錄病毒克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3基因克隆載體入噬菌體載體gtwes-λB

基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體痘苗病毒載體示意圖基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

（1）含義：指能在宿主細胞中穩定地復制并準確傳遞給子細胞的人工構建的染色體。（2）特點：能容納長達1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：構建基因組文庫,克隆和轉移完整的高分子量基因,基因功能鑒定,基因治療……

基因工程

2.3基因克隆載體（4）類型：線形的人工染色體：必須含有端粒、著絲粒和復制起始區。包含：酵母人工染色體（YAC)

人類人工染色體（HAC)

哺乳動物人工染色體（MAC)環形的人工染色體：不需要端粒和著絲粒，但必須含有合適的復制起始區。包含：細菌人工染色體(BAC)

源于噬菌體Ｐ1的人工染色體(PAC)

雙元細菌人工染色體(BIBAC)

可轉化人工染色體(TAC)基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）

常規基因整合平臺系統

內源平臺雙交換置換載體內源平臺雙交換插入載體內源平臺單交換插入載體外源平臺雙交換插入載體基因工程

2.3基因克隆載體基因工程

常規基因整合平臺系統loxP位點序列示意圖

基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統基因工程

2.3.4體內同源重組整合載體（系統）基因工程

基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統2.4.1目的基因來源

目的基因：在基因工程設計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預期表達產物的基因。

目的基因的生物來源:

真核生物染色體基因組

原核生物染色體基因組質粒基因組病毒（噬菌體）基因組

線粒體基因組葉綠體基因組

基因工程2基因工程2.4獲得目的基因2.4.2分離目的基因的途徑

利用限制性內切核酸酶酶切法直接分離目的基因

基因工程2.4獲得目的基因PCR擴增含目的基因DNA示意基因工程2.4.2分離目的基因的途徑

利用PCR直接擴增目的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑

目的基因的化學合成

通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑基因工程

通過構建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因

2.5.1受體細胞

原核生物

種類：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌、棒狀桿菌、放線菌等基因工程2基因工程2.5目的基因導入受體細胞特點：大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入;沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩;

基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養簡單,繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。基因工程

原核生物

真核生物特點：真核生物細胞具備真核基因表達調控以及表達產物加工和分泌等的機制，因此作為受體細胞表達真核基因優于原核生物細胞。

基因工程2.5.1受體細胞真核細胞模式圖種類：

酵母：基因結構相對比較簡單，便于基因工程操作；培養簡單，適于大規模發酵生產，成本低廉；外源基因表達產物能分泌到培養基中,便于產物的提取和加工；不含特異性的病毒，不產生毒素，是安全的受體細胞。植物細胞：具全能性。有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草和擬南芥等。動物細胞：目前多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞以及干細胞。有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。基因工程

真核生物

2.5.2重組DNA分子導入受體細胞

外源DNA轉化方法化合物誘導轉化法根癌農桿菌介導轉化法

電穿孔轉化法

微彈轟擊(基因槍)轉化法

基因工程2基因工程2.5目的基因導入受體細胞激光微束穿孔轉化法

超聲波處理轉化法脂質體介導轉化法

體內注射轉化法花粉管通道轉化法精子介導法低能離子束介導轉化法基因工程

外源DNA轉化方法電穿孔儀

病毒(噬菌體)顆粒轉導法

用病毒(噬菌體)的DNA（或cDNA）構建成重組DNA，在體外包裝成重組病毒(噬菌體)顆粒，通過感染使重組DNA進入受體細胞。

基因工程2.5.2重組DNA分子導入受體細胞方式：重組病毒直接感染受體細胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細胞重組病毒感染互補型受體細胞系適用：主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構建和動植物的轉基因。基因工程

病毒(噬菌體)顆粒轉導法基因工程

病毒(噬菌體)顆粒轉導法2.5.3克隆子的篩選

根據載體標記基因篩選轉化子根據載體抗菌素抗性基因篩選轉化子根據載體除草劑抗性基因篩選轉化子根據LacZ′基因互補顯色篩選轉化子根據生長調節劑非依賴型篩選轉化子根據核苷酸合成代謝相關酶基因缺失互補篩選轉化子基因工程2.5目的基因導入受體細胞

根據報告基因篩選轉化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

螢火蟲熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）

根據形成噬菌斑篩選轉化子

基因工程2.5.3克隆子的篩選2.6.1根據重組DNA分子特征鑒定重組子

根據重組DNA分子大小鑒定重組子

根據重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子

根據PCR擴增片段鑒定重組子基因工程2基因工程2.6重組子的鑒定

采用