姜曉星2015-10-22質(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒

染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子△在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體質(zhì)粒的特性分子量相對(duì)小（小于15kb）雙鏈環(huán)狀共價(jià)閉合分子含有高效自主復(fù)制成分不相容性（incompatibility）：有些質(zhì)粒不能共存于一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移性選擇的標(biāo)記（selectivemarkers)限制性內(nèi)切酶單一切口相同點(diǎn)（質(zhì)粒）不同點(diǎn)1、均攜帶遺傳信息2、可自主復(fù)制1、并非細(xì)菌生存所必須2、可通過(guò)傳遞的方式獲得3、可自行失去或人工消除染色體DNA質(zhì)粒DNA

分離質(zhì)粒DNA基本步驟

1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增

2、收集和裂解細(xì)菌3、分離和純化質(zhì)粒DNA1、細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)

瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落（單克隆）培養(yǎng)物中（含有適當(dāng)抗生素）37℃增菌2、細(xì)菌的收獲和裂解收集：離心質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml

質(zhì)粒DNA的大量制備500ml

裂解：

堿變性裂解法（說(shuō)明質(zhì)粒抗堿打擊力強(qiáng)）煮沸裂解法去污劑裂解法

煮沸裂解法

利用溶菌酶和TritonX-100破壞細(xì)胞壁，在將裂解液煮沸原理：加熱可使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性，但環(huán)狀質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)緊密而不會(huì)解鏈，溫度下降后，質(zhì)粒DNA又重新恢復(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，回收上清液中質(zhì)粒DNA

煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類(lèi)的菌株不適宜

SDS裂解法

比較溫和的抽提方法。將細(xì)菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解酚-氯仿抽提適合于大于15kb的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高堿變性法抽提質(zhì)粒DNA[原理]

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的在pHl2.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)pH=12.6pH中性染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，變性不能復(fù)性，沉淀質(zhì)粒DNA氫鍵斷裂，閉合環(huán)狀的互補(bǔ)鏈不完全分離復(fù)性，可溶[試劑]溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械切力作用而降解10mmol/LEDTA

螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對(duì)DNA的降解作用25mmol/LTrisHClpH8.0

不存在金屬離子的干擾溶液Ⅱ（制造堿性環(huán)境）：200mmol/LNaOH（必須新鮮配置，否則會(huì)結(jié)合空氣中的二氧化碳，形成碳酸氫鈉）pH＞12引起雙鏈間氫鍵的斷裂1%SDS①溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白；②解聚細(xì)胞中的核蛋白；③使蛋白變性而沉淀；④抑制核酸酶活性溶液ⅢpH4.8KAc（醋酸鉀）緩沖液

①將pH12.6的抽提液調(diào)至中性，使變性的DNA能夠復(fù)性②高鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀其他試劑TE緩沖液苯酚：氯仿1×LB溶液100μg/ml氨芐青霉素對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸裂解溶液II變性上清液抽提離心洗滌乙醇沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液堿裂解法流程圖實(shí)驗(yàn)步驟1.取液體培養(yǎng)菌液1.5ml置塑料離心管中，10000r/min離心lmin，去掉上清液（吸取，不要倒）。加入150μl溶液I，充分混勻（用槍打勻），在室溫下放置10min2.加入200μl新配制的溶液II，加蓋后溫和顛倒5～10次，使之混勻，冰上放置2min（不能長(zhǎng)時(shí)間變形）3.加入150μl冰冷的溶液III，加蓋后溫和顛倒5～

10次，使之混勻，冰上放置10min（充分反應(yīng)）4.用臺(tái)式高速離心機(jī)，10000r/min離心5min，將上清液移入干凈的離心管中（要記下上清體積，為下步準(zhǔn)備）[器材][操作]詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

質(zhì)粒DNA的酶切鑒定

限制性內(nèi)切酶

RestrictionEnzyme，RE

主要從原核細(xì)胞中分離獲得的一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列并水解的酶從核酸分子鏈內(nèi)部切斷核酸鏈，故稱內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是基因技術(shù)中不可缺少的工具II型酶（最常用）

通常指DNA限制性內(nèi)切酶

II型限制酶分子量小僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)輔助因子能識(shí)別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段因而在基因重組、DNA序列分析、基因組甲基化分析及基因物理圖譜等技術(shù)中廣泛應(yīng)用命名：（按酶來(lái)源的微生物學(xué)名）

1、取屬名的第一個(gè)大寫(xiě)字母種名的前兩個(gè)小寫(xiě)字母

2、同種內(nèi)有不同的株系加于基本名后

3、羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ來(lái)表示一株具有不同特異性的酶基本名

H

in

d

Ⅲ屬名Haemophilus種名influenzae株d種類(lèi)ⅠⅡⅢ流感嗜血桿菌中酶的命名

Ⅱ型內(nèi)切酶的特點(diǎn)識(shí)別特定的核苷酸序列，并在核苷酸的特定部位切開(kāi)核酸鏈識(shí)別的序列一般為4～6個(gè)核苷酸堿基對(duì)，且呈二重對(duì)稱的特異序列，稱為回文序列(palindrome)如：HindⅢ

-AAGCTT--TTCGAA-酶切的形式：1、平端切口

在兩段互補(bǔ)鏈對(duì)稱處的兩個(gè)堿基間切斷磷酸二脂鍵，產(chǎn)生沒(méi)有單鏈片斷的平端2、3’端粘性末端

錯(cuò)位切割，并偏向3’端，使3’端出現(xiàn)凸出的單鏈序列，稱為3’端粘性末端

3、5

’端粘性末端

錯(cuò)位切割，并偏向5’端，使5’端出現(xiàn)凸出的單鏈序列，稱為5’端粘性末端5’粘性末端3’粘性末端平端切口4、估算RE識(shí)別序列在DNA上出現(xiàn)的頻率識(shí)別序列的頻率=(1/4)N

HaeIII(4bp)=(1/4)4256bp

EcoRI、PstI(6bp)=(1/4)64096bp

NotI(8bp)=(1/4)865536bp(rarecutters)

僅是理論推測(cè)酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、酶切反應(yīng)一般在20μl或更小的體積中進(jìn)行，內(nèi)含0.2～1μgDNA2、酶切時(shí)間一般為1～3小時(shí)3、酶切溫度一般為37℃4、酶切pH值一般為7.5～8.0

（1）限制酶在50%的甘油中保存于-20℃時(shí)較穩(wěn)定（2）在冰箱外放置時(shí)間盡可能縮短（3）每次取酶時(shí)應(yīng)換一個(gè)無(wú)菌吸頭（4）確保加入體積不超過(guò)反應(yīng)體積的1/10

（5）延長(zhǎng)消化時(shí)間可使所需酶量減少5、限制性內(nèi)切酶使用注意356.限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活力（1）定義：限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能夠切割一些與其特異識(shí)別順序類(lèi)似的序列，這種現(xiàn)象稱星號(hào)活力

（2）表示：在相應(yīng)限制酶的名稱，右上角加一個(gè)星號(hào)（*）

（3）特點(diǎn)：星號(hào)活力的識(shí)別形式常對(duì)標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別順序中兩側(cè)的堿基沒(méi)有特異性

GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAA

EcoRI*37

（4）產(chǎn)生的原因高甘油含量（>5%V/V)內(nèi)切酶用量過(guò)大，一般為>100U/gDNA低離子強(qiáng)度<25mmol/L高pH值pH8.0含有機(jī)溶劑：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的離子存在（5）常見(jiàn)容易發(fā)生星號(hào)活力的酶有：

EcoRIHindIIIKpnIPstI

ScaI

SalIXmnIHinfI

BssHIIEcoRV

1、鑒定是否是需要的DNA片段

2、建立基因組圖譜

3、遺傳性疾病的研究和診斷

4、疾病易感性或抵抗基因的檢測(cè)

5、器官移植的配型

6、病原體的分型

7、藥物遺傳學(xué)和藥物基因?qū)W的研究

8、其它應(yīng)用

限制性內(nèi)切酶圖譜

也稱DNA物理圖譜，是DNA鏈上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的圖譜，可作為DNA片段的特殊標(biāo)記。是DNA特征的證據(jù)

內(nèi)切酶活性定義

在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性內(nèi)切酶的量，為一個(gè)活性單位限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）多態(tài)性

不同個(gè)體中同一位點(diǎn)上DNA核苷酸序列產(chǎn)生變異，且在人群中發(fā)生頻率大于1%RFLP產(chǎn)生的原因：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP

）

由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA順序多態(tài)性，估計(jì)人類(lèi)基因組中存在約幾百萬(wàn)個(gè)，約每1000個(gè)bp左右就有一個(gè)

RFLP——如在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)發(fā)生核苷酸的變異（或多態(tài)性），就