高中生物選修專題一基因工程第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四什么叫基因工程？

基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。該技術是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出人類所需要的基因產物。（一）基因工程的概念第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產物剪切→

拼接→

導入→表達第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA重組技術的基本工具分子手術刀—限制性內切酶分子縫合針—DNA連接酶分子運輸車—運載體第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶。4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結果：形成兩種末端一、“分子手術刀”——限制性核酸內切酶粘性末端平末端第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四什么叫平末端？當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四限制性內切酶特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，在特定的切點切割。舉例：大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端，SmaⅠ能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端。第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四拓展（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端，在切開后的序列正著讀和反著讀堿基序列都一樣稱之為回文序列回文對：

乾隆客上天然居，居然天上客；紀曉嵐人過大佛寺，寺佛大過人。第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四二、“分子縫合針”——DNA連接酶1、DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，是把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子才能形成。第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四②DNA連接酶——分子縫合針：E.coliDNA連接酶：只能連黏性末端。T4DNA連接酶：還能連平末端，但效率較低。來源：前者源于大腸桿菌；后者源于T4噬菌體。大腸桿菌T4噬菌體第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四不同來源DNA片斷結合雙鏈斷開EcoRI切割第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四1.作用：

要讓一個從甲生物細胞內取出來的基因在乙生物體內進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。將外源基因送入受體細胞。

3、分子運輸車—運載體第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四2、載體的種類1、質粒：是一種裸露、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子；2、λ噬菌體的衍生物；3、動植物病毒等。第14頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四作為運載體必須具備的條件1.能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存。2.具有一個或多個限制酶切割點，便于供外源DNA片段插入。3.具有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

3.質粒特點：第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四三、基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取1.基因的結構2.目的基因的概念3.目的基因的獲取的方法第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四1.基因的結構（1）原核生物基因結構編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游編碼區下游編碼蛋白質調控遺傳信息的表達（調控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四編碼區非編碼區非編碼區（能編碼蛋白質）啟動子終止子真核與原核生物基因結構的比較外顯子內含子編碼蛋白質（不能編碼蛋白質）①相同點：都是由能夠編碼蛋白質的編碼區和具有調控作用的非編碼區。②不同點：原核細胞基因的編碼區是連續的；真核細胞的編碼區是間隔的，不連續的。（2）真核生物基因結構第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四2.目的基因的概念主要是指編碼蛋白質基因，也可以是一些具有調控作用的因子。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四3.目的基因的獲取的方法（3）用化學方法直接人工合成目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因（2）應用PCR技術擴增目的基因第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四（1）從基因庫中獲取目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念②基因組文庫和cDNA文庫的主要區別③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四①基因文庫和部分基因文庫的慨念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫。基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存（基因組文庫）目的基因分離第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四部分基因文庫的建立方法mRNA反轉錄酶單鏈DNA合成雙鏈DNA（cDNA）

載體插入導入受體菌群（cDNA文庫）分離目的基因第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四cDNA合成過程

第一步：反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。26第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四②基因組文庫和cDNA文庫的主要區別文庫類型cDNA文庫基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因

根據目的基因的有關信息例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四（2）應用PCR技術擴增目的基因①定義：②原理：DNA復制

PCR是多聚酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，在短時間內大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結合成雙鏈）因此，在PCR技術中不需要解旋酶（與復制不同之在處)③儀器：PCR擴增儀（自動調控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物，脫氧核苷酸，酶等。第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四④過程：a.DNA熱變性（90～95OC)：b.復性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重復a.b.c步驟：

雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNA系統溫度降低，引物結合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA

在Taq酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形成雙鏈DNA每重復一次，目的基因增加一倍PCR擴增為指數形式擴增2n(n為擴增循環的次數），在短時間內擴增大量目的基因。第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四(3)用化學方法直接人工合成目的基因蛋白質氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目的基因序列→目的基因針對：基因比較小，核苷酸序列又已知推測化學合成推測第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四1.目的：二.基因表達載體的構建——核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達和發揮作用。(3)終止子(4)標記基因(2)啟動子(1)目的基因

不同受體細胞，目的基因導入受體細胞的方法不同，基因表達載體的構建有所差異。第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四質粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種基因表達載體的構建33第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四三、將目的基因導入受體細胞1.轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的工程2.常見轉化方法：①農桿菌轉化法：雙子葉植物和裸子植物。（1）將目的基因導入植物細胞③基因槍法：單子葉植物。

②花粉管通道法（3）將目的基因導入微生物細胞—感受態細胞法。（2）將目的基因導入動物細胞——顯微注射法。第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四①特點:

農桿菌轉化法：（1）將目的基因導入植物細胞能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數單子葉植物沒有感染能力②過程：Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四基因槍法：利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因導入單子葉植物細胞鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第36頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四舊式的基因槍靠火藥為動力，將子彈頭上粘的ＤＮＡ打出。其原理和聲音都與鳥槍相仿，成功率僅為千分之八。小圖為子彈第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四新式的基因槍靠高壓氦氣為動力，將微粒載片上的ＤＮＡ送出，成功率在１５％左右。小圖為微粒載片和阻擋網。第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四手提式基因搶第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞①操作方法：②特點：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞十分簡便經濟③例：轉基因抗蟲棉第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（2）將目的基因導入動物細胞發育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養成早期胚胎顯微注射取受精卵（體內或體外受精）提純含目的基因表達載體受精卵第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四倒置顯微注射儀德國萊卡公司將目的基因導入動物細胞：第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四③常用法：②常用菌：①微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態細胞Ca2+處理大腸桿菌感

受

態

細

胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA___感受態細胞法（3）將目的基因導入微生物細胞第43頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四四目的基因的檢測與鑒定（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學水平的鑒定：抗蟲、抗病結種實驗，活性比較實驗1.檢測方法：分子雜交技術：第