生產用種細胞鑒定的相關檢測技術摸索與把握1、前言

在歷史上，由于細胞源性的生物制品存在外來的污染物或出于對用于制備產品的細胞性質方面的考慮，引發了一些對產品質量的關切。重組DNA(rDNA)制品的質量也與細胞基質中構建的表達載體有關：由此，人們用連續傳代培育的細胞生產生物技術產品及生物制品的最大優點是使每批基質(或細胞庫)用于生產，摸索與把握生產用種細胞鑒定的相關檢測技術并必需重建立細胞庫，這將延誤產品上市或開發的時機。2、目前的生產用種細胞庫及其檢測技術現狀分析生產部門各車間雖儲藏了一些細胞資源，有細胞庫的存在，但不完善，比方一些細胞只有粗略簡潔的記錄〔凍存人和日期，對于其傳代的穩而在實際生產中，由于生產用細胞存在外來污染物給生產帶來了不小的影的污染。由于競爭養分成分及支原體代謝產物的毒性作用，細胞生長活性受到影響，胞變圓并從培育瓶壁上脫落等，很大程度上影響生產以及苗毒質量的提高。例如08年的藍耳生產，由于組織了相關提高藍耳毒價系列試驗，對其工藝狀態不好，病毒生殖不抱負。后取細胞樣送檢，均支原體陽性，足見其對生產造成的影響是不容無視的。能最終定論，而我公司在固體培育基的支原體檢測技術方面不太成熟。細胞系鑒定和檢測的一般原則：對建系細胞基質的鑒定和檢測是生物(如來自于宿主的毒素或抗生素)進展評估。檢測的目的是為了證有用于生產的細特性(如生長的需求)、它的培育歷史(如人源和動物源性的生物試劑的使用)還要對每一個工作細胞庫作純度和有限的鑒別試驗,而我們在這一塊存在檢測漏洞,故在此對相關檢測技術進展開展和完善.3、目的與意義質量奠定根底。4、試驗方案4、1方案一 支原體培育基的配制及其檢測試驗試驗目的種細胞是否受支原體污染，以能觀測到典型支原體菌落為陽性判定標準。試驗人員：試驗時間：91日——1230日試驗方法檢測方法一直接購置豬鼻支原體合成培育基按其使用方法進展檢測檢測方法二依據《中華人民共和國獸用生物制品規程》進展檢測材料與器材材料:豬鼻支原體菌種、制備培育基相關藥品器材:小試管、長吸管、錐形瓶、玻璃棒、天平、量筒、燒杯、平皿、正壓不銹鋼濾器、除菌濾膜、高壓滅菌鍋、pH計、顯微鏡、移液槍、二氧化碳培育箱培育基的制備液體培育基PPLO肉湯粉葡萄糖21g5g10%精氨酸溶液10ml1%醋酸鉈溶液10ml25%酵母浸出液100ml10MEM10ml8萬單位/ml青霉素溶液10ml豬〔馬〕血清100ml1%酚紅溶液1ml雙蒸水1000ml1mol/LpH7.8，過濾除菌，定量分裝，置固體培育基PPLO肉湯粉21g葡萄糖5g1%醋酸鉈溶液10ml25%酵母浸出液100ml瓊脂粉15雙蒸水1000ml2-8℃保存備用。添加成分固體培育基 100ml血清 10ml8萬單位/ml青霉素溶液 1ml10%精氨酸溶液 2ml10倍MEM 1ml使用前將瓊脂培育基加熱溶解，當溫度降到60℃左右添加關心成分。檢測方法液體培育基培育 取待檢樣5ml，接種小瓶液體培育基中，再從小瓶中取0.2ml移植接種于一小管液體培育基中，將小瓶與小管放37℃培育，分別于接種后5日、10日、15日從培育瓶中取0.2ml培育物移植到小管液體培育基內，每日觀看培育物有無顏色變化，假設無變化，則在最終一次移植小管觀看14日后，觀看在觀看期內假設覺察小瓶或任何一支小管培育物顏色消滅明顯變化，在原pH值變化達±0.5時，應馬上移植于小管液體培育基和固體培育基，觀看液體培育基中是否消滅恒定的pH變化及固體上有無典型的煎蛋狀支原體菌落。固體培育基培育 在每次液體培育物移植小管培育的同時，取培育物0.1ml在液體培育基顏色消滅變化在原值變化達±0.5時也同時接種瓊脂平板每5-7日在低倍顯微鏡下觀看檢查各瓊脂平板有無支原體菌落消滅經14日觀看仍無菌落者停頓觀看。每次檢查時需設陰、陽性比照，在同條件下培育觀看。結果判定 被接種物的任何一個瓊脂平板上消滅支原 體菌落，判陽性。假設陽性比照中至少一個平板消滅支原體菌落而陰性比照中無支原體生長則檢驗有效。備用檢測方法一1.配方KM2液體培育基EaglesMEM 450mL／L1％醋酸鉈12．5mlML酵母浸出粉1．0g／L0．4％酚紅1．75mL／L1mol／LNaOHpH7．6—7．8(121℃)15min420萬單位／L310mL／L、滅菌安康豬血清200mL/L2.方法培育培育。每日觀看其顏色變化，并與陰性比照進展比較。每3天傳代13-4(15000／rain02mol／L的PBS緩沖液中。姬姆薩氏染色法230mJn100X倍顯微鏡下觀看。.鑒定試驗染色鏡檢檢。一般培育基生長將傳代的單菌落液體培育基接種一般肉湯瓊酯板，濕盒37℃培育。兔血培育基生長濕盒37℃培育吸附紅細胞20rnin，用生理鹽水洗滌2～3次。生化試驗葡萄糖細菌微量發酵生化鑒定管(北京路橋技術有限責任公司)，37培育。備用檢測方法二配方一種高效支原體培育基根底培育基：9.0-11.0ｇ穎牛肉提取純粉９．０－１１．０ｇ氯化鈉４．０－６．０ｇ磷酸二氫鉀０．４－０．６ｇ蒸餾水１０００ｍｌ液體培育基內還加有：生牛血清９０－１１０ｍｌ９０－１１０ｍｌ１０％尿素溶液或１０％精氨酸溶液５－１５ｍｌ０．４％酚紅溶液４－６ｍｌ青霉素５００－２０００ｕ／ｍｌ固體培育基內還加有：瓊脂１．２－１．４％備用檢測方法三1、配方：支原體肉湯培育基成分加量豬胃消化液500ml牛肉浸〔粉〕液500ml酵母浸液5.0g氯化鈉2.5g葡萄糖5.0g酚紅0.02g將上述成分混合溶解，分裝于玻璃管中，每支8ml121℃高壓滅菌15min備用。基。13.0-15.0g瓊脂即可。2、檢查操作方法：〔或支原體固體培育基10支。操作程序0.22ul除菌濾膜濾后備用10-15min完全溶化，56℃左右備用。按無支原體滅活小牛血清：12.5萬單位/ml青霉素=20：1的比例混合〔假設是分別原體用，可按無支原體滅活小牛血清：1.2%醋酸鉈：12.5萬單位/ml青霉素=2：2：1，參加到支原體肉湯培育基及56℃左右支原體半流體培育基或固體培育基中〔牛血清、醋酸鉈青霉素的使用終濃度分別為17%、、2023U/ml)2.0ml.cell參加到上述預備好培育基中，每份樣品接種支原體半流體培育基及支原體肉湯培育基〔固體培育基〕40.5-1.0ml,置〔36±0.5〕℃培育21天，每三天觀看一次，留兩支比照同等條件下培育。2支進展傳代培育〔另1.0ml,置〔36±0.5〕℃21天，每三天觀看一次。結果判定試驗成立。培育基比照陰性，試驗成立，結果有效。陰性。試驗到期接種樣品的初種及轉種培育基〔8支〕均無支原體生長。復試。如疑有支原體生長，應取加倍量供試品在上述2種培育基上進展〔1.0-2.0ml)經復試后無支原體生長則判合格。疑經復試后仍有支原體生長，則為陽性結果，判定供試品被支原體污染。備用檢測方法四1、配方1LPPLO肉湯粉 21g酚紅 0.02g馬血清 200ml15%酵母浸出液 100ml10×MEN培育液 100ml600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解，121℃15min200ml馬血清10ml/4℃一個月。固體培育基1LPPLO肉湯粉21g酚紅0.02g細菌瓊脂15g蒸餾水600ml馬血清200ml15%酵母浸出液100ml10×原液100ml熱溶解，121℃15min滅菌，放入5050℃時于無菌操作臺15%100ml10×原液，混勻5ml/培育皿，4℃，1個月。2、操作步驟37℃培育1-20.1ml液體培育液3周，持續觀看有無菌落消滅。另取取1mlcell培育液或0.2mlcell懸液涂抹于固體培育基上cell的穎培育基。4、2方案二 細胞核型分析4、2、1目的與意義,將特定的細胞系用于疫苗生產前,必需對細胞進展全面的鑒定,其中細胞的核型分析是鑒定的重要組成局部,,,為物IBRS-2細胞不同代次的染胞進展代次使用狀況的監控與把握。31日試驗人員:4.2.3 試驗材料細胞:IBRS-2原始細胞來源于生產細胞庫，根底細胞、工作10代細胞均由本組自行傳代培育。藥品:甲醇,分析純,;冰醋酸,分析純,沈陽市欣西試劑廠;Giemsa,BIOBASIC公司產品。器材:離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等4、2、4試驗方法(80%集合),參加秋水372～3h后,用常規方法消化,轉入離心管中,8min,0.5%KCl溶液懸浮細胞,3720min,參加穎固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1mL,混勻,2min,8min,2mL,混勻,30min,8min,4mL穎固定液,20min,,據懸液中細胞密度大小,留取適量固定液,吸打均勻45°傾斜,用吸管將載玻片拂過酒精燈幾次,觀看,假設細胞能均勻的鋪展,中期相不重疊,則用同樣細胞濃度樣品多制備幾份樣品。否則要進一步稀釋細胞懸液,或者調整滴片高度,以到達滿足的鋪片效果。用Giemsa染色,Giemsa9PBS(pH=6.8)混合配成染色液(現用現配)15～30min,流水沖冼(沖片子的反面),水漂洗,晾干。Giemsa染色法：染液制備Giemsa充分混合，研磨至無顆粒；233ml純甲醇，保存于棕色瓶內。(以蓋片培育法或涂片法為例)pH6.8PBS1：9GiemsaPBS緩沖液混合配成染色液；把染色液布滿玻片上(留意不要有氣泡，用染色缸染色亦可)；染10～15分鐘后，用自來水沖去玻片上多余的染料，空氣枯燥、二甲〔70ml蒸餾水中〕光學樹脂膠封固。結果胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿染成粉紅色。留意事項：染色液宜現用現配，保存時間最好不超過48小時，舊染液染色效果不好。另外GiemsapHpH值要調準確，否則染色層氧化膜(發亮)，這層氧化膜易附在片上形成污穢，且不易除掉。因此在水直接沖掉多余染液。,周緣清楚的中期分裂10×100倍顯微鏡下照相,進展剪貼、排序，對分裂對長度,leven(1964)標準劃分染色體形態。4、2、5結果與分析4、3方案三 外源病毒檢測4.3.1目的與意義學習并把握對生產用細胞進展外源病毒檢測的相關檢測方法,看其是否受污染,對已受污細胞進展排查.30日試驗人員：試驗方法依據《中華人民共和國獸用生物制品規程》檢測方法進展檢測將待檢細胞凍融后,過濾除碎片.Vero細胞單層(100cm2),1ml.連傳兩代,每代7日