食品檢測食品衛(wèi)生細菌學檢驗第1頁/共58頁第一節(jié)食品中菌落總數(shù)的測定第2頁/共58頁一、菌落總數(shù)

是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后,所得1mL(g)或1cm2面積檢樣中所含菌落的總數(shù)。

第3頁/共58頁二、菌落總數(shù)測定的意義1、判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、預測食品存用的期限長短。3、了解細菌在食品中的繁殖動態(tài)。第4頁/共58頁三、菌落總數(shù)測定的方法※平板傾注法＃平板表面涂布法平板表面點滴法第5頁/共58頁第6頁/共58頁（一）、樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃營養(yǎng)瓊脂12~15ml25g/ml樣品生理鹽水第7頁/共58頁

檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

第8頁/共58頁（二）培養(yǎng)普通食品:37℃48h倒放平板清涼飲料、調(diào)味品、糕點、酒類：37℃24h水產(chǎn)品:30℃48h第9頁/共58頁（三）計數(shù)和報告

到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。第10頁/共58頁1、菌落的選擇（1）、單個菌做一個菌落計（2）、呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算。（3）、如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。第11頁/共58頁2、平板菌落計數(shù)的選擇

（1）、選取菌落數(shù)在30～300之間的平板（SN標準要求為25～250個菌落），若有二個稀釋度均在30～300之間時，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。第12頁/共58頁（2）、如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（3）、如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告（4）、如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（5）、如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。

第13頁/共58頁3、菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在1～100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。

第14頁/共58頁(四)、檢驗注意事項1、對照平板出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板；2、吸管進出瓶子或試管時，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進行稀釋時,吸管口不得與稀釋液接觸;第15頁/共58頁5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min.6、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。第16頁/共58頁復習題1、什么是菌落總數(shù)？2、測定食品、飲料等產(chǎn)品的菌落總數(shù)有什么意義？3、畫出平板傾注法測定菌落總數(shù)的示意圖。4、在測定菌落總數(shù)時，如何選擇菌落進行計數(shù)？5、在菌落總數(shù)的檢驗中，要注意哪些事項？6、在菌落總數(shù)的檢驗中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時間？第17頁/共58頁第二節(jié)食品中大腸菌群的檢驗第18頁/共58頁一、大腸菌群

1、

什么是大腸菌群？

指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌發(fā)屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。第19頁/共58頁屬代表種致病性埃希氏菌屬（Escherichia）大腸埃希氏菌(E.coli)腸道外感染，急性腹瀉志賀氏菌屬（Shigella）痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)細菌性痢疾愛德華氏菌屬（Edwardsiella）遲純愛德華氏菌(E.tarda)蛇類等血動物的正常腸道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門氏菌屬（Salmonella）傷寒沙門氏菌(S.typhi)腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)弗勞地氏枸櫞酸桿菌(C.freundii)條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染敗血癥等陰溝腸桿菌(Enterobacter)產(chǎn)氣桿菌(E.aerogenes)很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬(Hafnia)蜂窩啥夫尼亞菌(H.alvei)對人無致病性沙雷氏菌屬(Serrati)粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)條件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及創(chuàng)傷感染變形桿菌屬(Proteus)普通變形桿菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶爾森氏菌屬(Yersinia)鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)鼠疫歐文氏菌屬(Erwinia)草原居民歐文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到第20頁/共58頁1、糞便污染的指標菌：大腸菌群或大腸桿菌二、大腸菌群的測定意義第21頁/共58頁2、以大腸菌群作為糞便指標菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時間與致病菌大體相同；檢測方法簡便容易。第22頁/共58頁3、大腸菌群的測定意義（1）、判斷食品中否受到糞便污染。（2）、有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）、有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。第23頁/共58頁三、大腸菌群的生物學特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣

3.培養(yǎng)特性：在ＥＭＢ瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。第24頁/共58頁EMB平板照片及原理第25頁/共58頁麥康凱瓊脂平板Ageofcultureis24h第26頁/共58頁大腸桿菌、大腸菌群選擇性顯色培養(yǎng)基--COLIID用于在37℃下對食品中大腸菌群和大腸桿菌進行檢測、計數(shù)及大腸桿菌的鑒定本培養(yǎng)基含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識別大腸菌群（coliforms）和鑒定大腸桿菌（Escherichiacoli）,而不需附加任何試劑。

菌落顏色玫瑰紅藍色透明.

β-葡萄糖苷酶+

-

-

.

β-半乳糖苷酶+

+

-

.

大腸桿菌其它大腸菌群其它革蘭氏陰性菌.

β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在

β-葡萄糖苷酶（+）大腸桿菌存在β-葡萄糖苷酶（-）無大腸菌群存在

第27頁/共58頁大腸桿菌平板菌落照片

腸桿菌掃描電鏡照片.第28頁/共58頁四、大腸菌群檢驗方法及操作方法國家標準：三步法：乳糖膽鹽發(fā)酵試驗→分離培養(yǎng)→證實試驗(乳糖發(fā)酵試驗)

行業(yè)標準：兩步法：推測試驗→證實試驗第29頁/共58頁檢樣稀釋處理EMB等革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管革蘭氏陰性無芽胞產(chǎn)氣革蘭氏陽性大腸桿菌陰性大腸桿菌陰性報告不產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸桿菌陰性報告報告報告大腸桿菌陽性第30頁/共58頁1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml單料乳糖膽鹽發(fā)酵管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管初發(fā)酵檢樣稀釋檢樣量1g/ml檢樣量0.1g/ml檢樣量0.01g/mlEMB分離培養(yǎng)證實試驗乳糖發(fā)酵管鏡檢查MPN表報告結(jié)果第31頁/共58頁表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅蘭培養(yǎng)基(EMB)紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色品紅亞硫酸納(遠藤氏平板)紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金屬光澤，淡紅色、中心較深中國蘭平板深藍色，淺藍色、中心深藍色麥康凱平板(MacC)桃紅色，粉紅色、中心桃紅色第32頁/共58頁MPN法簡介TheMostProbableNumberMethod第33頁/共58頁100g/ml檢樣中最近似值(MPN)表以1、0.1、0.01、各用3管。陽性管數(shù)MPN個/100g/ml1g/ml×30.1g/ml×30.01g/ml×3000＜30

001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190第34頁/共58頁大腸桿菌檢驗流程均質(zhì)，接種9支LST發(fā)酵管接種EC發(fā)酵管EMB平板劃線可疑菌落斜面純化生化反應：IMViC報告結(jié)果培養(yǎng)48小時培養(yǎng)48小時培養(yǎng)24小時培養(yǎng)24小時96小時1天+2天+1天+1天+4天=10天第35頁/共58頁五、糞大腸菌群的檢驗糞大腸菌群：系一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。第36頁/共58頁檢驗方法檢樣產(chǎn)酸產(chǎn)氣查MPN表報告EMB分離靛質(zhì)基試驗陽性反應方法一：45℃EC肉湯發(fā)酵稀釋44℃乳糖膽鹽發(fā)酵方法二：檢樣稀釋36℃乳糖膽鹽發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣EMB分離查MPN表報告第37頁/共58頁1、從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。2、對產(chǎn)酸但未看到氣泡的乳糖發(fā)酵，用手輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產(chǎn)生，應作進一步試驗。

3、挑選菌落進行證實試驗時，最少要挑2個以上的典型菌落或非典型菌落進行接種。4、不可用其他膽鹽代替指定的膽鹽。六、檢驗注意事項第38頁/共58頁七、大腸菌群快速檢驗食品大腸菌群快速檢驗方法：TTC顯色法；DC試管法；紙片法。第39頁/共58頁（一）食品飲料大腸菌群快速檢驗紙片

使用方法：1.樣品稀釋同國標法2.接種：飲料和飲用水采用原液、1:10、1:100三個稀釋度，固體食品采用1:1、1:10和1:100三個稀釋度。用1亳升滅菌吸管吸取1亳升同一稀釋度的稀釋液均勻涂布到袋中的紙片上，做三個重復。第40頁/共58頁3.培養(yǎng)：將接種好的紙片輕輕壓平（可疊放），在36℃下培養(yǎng)15－24h觀察結(jié)果。4.結(jié)果判定:紙片上出現(xiàn)紫紅色斑點,其周圍有黃圈者,為陽性.紙片為一種著色,無菌落生長者為陰性.紙片呈紫蘭色,有紫紅色斑點，其周圍地黃圈者陰性.酸性食品接種后,紙片變黃,經(jīng)培養(yǎng)后無紫紅色斑點為陰性第41頁/共58頁（二）餐具大腸菌群快速檢驗(紙片法)使用方法：1.

采樣6—10份。碗、盤、杯等每份貼紙片兩張，用無菌生理鹽水濕潤紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30秒后取下，置于原塑料袋內(nèi)。筷子以5只為一份樣品，用吸管吸取生理鹽水濕潤紙片后，立即將筷子進口端（約5cm）抹拭兩張，放入原塑料袋內(nèi)。第42頁/共58頁2.將已采樣的紙樣置于37°C培養(yǎng)15小時.紙片在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點為陽性，紙片在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點，但周圍沒有黃暈均為大腸菌群陰性。同一份樣品兩張紙片均是陰性為合格。第43頁/共58頁食品冷飲大腸菌群檢驗紙片

冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測定第44頁/共58頁食品飲料大腸菌群快速檢驗紙片

飲料、食用純水和糕點的大腸菌群測定第45頁/共58頁餐具大腸菌快速檢驗紙片

餐具衛(wèi)生消毒效果檢測第46頁/共58頁大腸菌群測試片

適用于需要對大腸菌群準確計數(shù)的樣品，如消毒牛乳、冷飲和調(diào)味品等。

第47頁/共58頁1.主要修改內(nèi)容大腸菌群的MPN法中乳糖膽鹽為主的培養(yǎng)基修改為月桂基硫酸鹽胰蛋白眎(LST)肉湯為主的培養(yǎng)基；增加了大腸菌群的平板計數(shù)法和紙片檢測法；大腸菌群MPN法中檢測結(jié)果報告原“每100g（mL）大腸菌群的MPN值”，修改為“每1g（mL）大腸菌群的MPN值”。增加了大腸桿菌的MPN法、固體培養(yǎng)基法（VRB+MUG的方法）和紙片法。第48頁/共58頁八、水的大腸菌群檢驗大腸菌群MPN/100mL細菌總數(shù)

CFU/mL

生活飲用水

≤3/L＜100

瓶裝飲用純凈水

≤3

≤20

飲用天然礦泉水罐裝產(chǎn)品0＜50地面水質(zhì)量標準

＜10000個/L

準備加氯消毒后供飲用的水≤1000準備加氯消毒后供飲用的水≤10000游泳池水≤100＜1000第49頁/共58頁（一）、水樣的采集

1、自來水（未含氯）：龍頭火燒滅菌，暢流5—10′后取樣。2、地面水源水：江湖河，水庫，水池等。浸入水下20cm下取樣。水井50cm下取樣。3、漂白粉處理的水樣：自來水，游泳池水，應在瓶內(nèi)加入0.03g硫代硫酸鈉/500ml，或2ml1.5%硫代硫酸鈉液/500ml，除氯。4、運送：2小時內(nèi)送到檢驗室。6—10℃，<6h,立即檢驗.5、檢驗前：將水樣振搖5—10分鐘。第50頁/共58頁（二）、生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗（大腸菌群）

各加10ml各加100ml水樣初發(fā)酵三料乳糖膽鹽50毫升裝三料乳糖膽鹽5毫升裝EMB分離36℃培養(yǎng)24h復發(fā)酵乳糖發(fā)酵鏡檢36℃培養(yǎng)24h第51頁/共58頁大腸菌群檢索表（飲用水）100ml陽性管數(shù)10ml陽性管數(shù)012每L水中大腸菌群數(shù)0＜3411138182713273111838414245251830706223692727431208