腫瘤分子檢測與質量控制第1頁/共35頁醫學發展歷程的啟示經驗醫學循證醫學精準醫學診斷靠治療后期經驗積累。診斷治療以人群、科學研究證據指導臨床實踐。診斷治療以個體為基礎，更加提前、具體與精確。分子時代第2頁/共35頁第3頁/共35頁腺癌鱗癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：EGFR\KRAS\BRAF\ALK-ROS1\RET等檢測已是共識；肺鱗癌發生模式不同，檢測靶標以擴增為主，同時EGFR、ALK\ROS1某些病例也有必要檢測。第4頁/共35頁我們可以用的分子生物學手段：實時熒光PCR方法（擴增阻礙突變系統法（AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS）、PCR-高分辨溶點曲線分析（HRM）、數字PCR等）PCR-雜交法（膜上、芯片[基因芯片]、乳膠顆粒[Luminex]）PCR-Sanger測序PCR-焦磷酸測序新一代高通量測序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等熒光原位雜交（FISH）直接雜交免疫組化第5頁/共35頁分子病理檢測的主要方法基因突變(SNPs)拷貝數改變(CopyNumberVariation,CNV)基因重排（Gene

rearrangement)檢測技術蛋白(質)表達(Proteinexpression)免疫組織化學（IHC）…基因表達(mRNA/RNA

expression）反轉錄+熒光定量PCR（RT-qPCR)…FISH…DNAsequencing，

ARMS…檢測對象檢測基因檢測水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA,BCR-ABL，JAK2…EML4-ALK，ROS1，HER2，RET…BRCA1，TOP2A，TYMS…EGFR，EML4-ALK，HER2…第6頁/共35頁是RT-PCR平臺上的特異擴增技術（易開展）共發表300多篇文獻著名的大型臨床研究

-如IPASS、INFORM等國際肺癌協會專家共識

中國基因突變檢測專家共識

日本臨床專家共識IPASSINFORM大型臨床研究所采用ARMS技術

——被臨床證明的腫瘤基因突變檢測技術第7頁/共35頁DNA基因重排融合mRNA或5’/3’mRNA差異表達嵌合蛋白表達肺癌中ALK基因變異的表達調控FISH/CISHNGSRT-PCR5’/3’比較qRT-PCRRACE-PCR…IHC第8頁/共35頁熒光原位雜交技術（FISH）2個信號分離直徑的要求，使實際應用中結果難以判斷有5-11%出現假陽性信號分離1，2，3工作強度大，費時主觀性強，受人為因素影響大橫向縱向1.FISH技術是美國藥物臨床試驗中所采用的檢測方法。2.采用“分離”分析，基因倒位和ALK重排后，紅色和綠色探針分開3.≥15%的樣本細胞中呈現分開的紅色和綠色信號表示陽性結果1第9頁/共35頁操作簡單，時間短結果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響除FFPE樣本外，還適用其他類型樣本組織1與EGFR、RET、ROS1等其他檢測不沖突，共用相同組織切片和PCR擴增程序，節約有限資源和時間中國熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國情NTCPCFusionSample實時逆轉錄法（RealTime-PCR）第10頁/共35頁CFDA批準的基因檢測產品項目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHC

√

FISH

√

RealTime-PCR√√√√基于RealTime-PCR方法檢測驅動基因的分子診斷產品獲得CFDA批準最多第11頁/共35頁2-3片FFPE樣品同時將DNA和RNA分離出來同時獲得EGFR、ALK和ROS1檢測結果節約樣本、節約時間、節約成本DNA/RNAEGFR突變型ALK陽性或ROS1陽性EGFR野生型ALK陰性ROS1陰性吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼克唑替尼色瑞替尼其他治療方式DNA/RNA共分離劑盒EGFR/ALK+ROS12.5小時PCR4.5小時FFPE切片1-3片或活檢小標本第12頁/共35頁2015NSCLC

NCCN指南對于NSCLC患者建議檢測EGFR和ALK基因狀態；對于ROS1/MET/RET/BRAF/HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關注第13頁/共35頁1.室內質量控制2.室間質量評價分子病理實驗室的質量控制第14頁/共35頁1.建立標準化的實驗室2.具備資質且相對固定的人員3.性能穩定的試劑4.持續不斷的學習和開展質控第15頁/共35頁《醫療機構臨床基因擴增檢驗室管理辦法》（衛辦醫政發[2010]194號）《醫療機構臨床基因擴展檢驗實驗室工作導則》（衛辦醫政發[2010]194號）第16頁/共35頁試劑準備區空氣流向標本制備區空氣流向擴增區空氣流向產物分析區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間工作走向第17頁/共35頁第18頁/共35頁第19頁/共35頁第20頁/共35頁FISH實驗區第21頁/共35頁臨床基因擴增實驗室標準化操作文件（sop）1.寫你所做2.做你所寫3.實驗室的精髓可操作性的sop文件第22頁/共35頁人員資質第23頁/共35頁理想的試劑試劑方法的性能驗證及每批試劑的質檢性能指標：

重復性（精密度）

準確性（定量：回收率、標準物質等；定性：方法學比較等）

線性范圍（定量）

分析特異性

測定下限

抗干擾能力第24頁/共35頁

資質認證試劑質量試劑反應性能前后批號結果一致性測定下限批內變異（<10%)和批間變異（<15-25%)第25頁/共35頁你其實做了這些，但是你有記錄么？1.日常維護2.定期保養3.維修記錄實驗室最忠實的員工-----儀器第26頁/共35頁全流程：標本接收-石蠟切片-核酸提純-實時熒光定量PCR擴增-結果分析分析前：標本接收、制片、填寫檢測申請單分析中：核酸提取、擴增、產物分析、檢測有效性判斷分析后：結果分析、報告審核、結果解釋標準：重復，可控，規范全流程室內質控第27頁/共35頁組織蠟塊切片病理學評估核酸純化實驗/數據DNA模板質量更重要，建議對提取的DNA模板進行質量檢測：

OD260/OD280=1.8±0.2，

OD260/OD230≥1.7全流程室內質控第28頁/共35頁檢查設定參數平臺期背景熒光閾值線設定閾值檢查對照組及內外控曲線情況陽性質控品突變樣本突變分析第29頁/共35頁第30頁/共35頁RNA制備逆轉錄選用CFDA認證的檢測試劑認證的核酸抽提試劑病理小樣本中性福爾馬林組織保護液快速低溫放置微量紫外分光光度計Q-PCREGFREML4-ALKK-rasB-rafPI3K好流程才有好結果FFPE-DNAFFPE-RNAFFPE-DNA/RNA血清/血漿游離DNA