ngs與其他檢測序技術流程的對比臨床常用診斷技術2腫瘤診斷方法影像學診斷：超聲，CT，MRI，PET，PET-CT組織細胞形態學診斷：

-HE染色-辨別腫瘤細胞及分型免疫組化診斷：-利用抗原抗體結合反應原理

-針對蛋白類腫瘤標記物（癌胚抗原，糖類抗原，

甲胎蛋白等）的檢測-鑒別組織來源分子診斷：

-熒光原位雜交（FISH）、基因探針及標記、多聚酶鏈式反應（PCR）、

DNA序列分析（sanger測序、ARMS法、二代測序）等-針對腫瘤的癌基因/抑癌基因、生長因子及受體,以及腫瘤相關的某些染色體

位點異常的檢測

3組織病理學檢查仍是癌癥診斷的“金標準”ACSCSCCLC4FISH

ARMS腫瘤點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本腫瘤病理診斷治療已進入個體化分子時代

免疫組化

一代測序

數字PCR

二代測序檢測方法的介紹免疫組化（IHC）熒光原位雜交（FISH）桑格測序（Sanger測序法）擴增阻滯突變（ARMS）-PCR法數字PCR（ddPCR）二代測序檢測方法介紹6免疫組化染色原理：根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。免疫組化是從蛋白層面看問題的，與測序不同，一個是因（DNA），一個是果（Protein），所以體內出現一些未知突變，如果對蛋白功能產生影響，也是可以看出來的。70分1分2分3分熒光原位雜交（FISH）定義：熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結果的一種分子細胞遺傳學技術。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。分析9熒光原位雜交(FISH)檢測——以HER2為例FISH檢測乳腺癌細胞HER2擴增代表性圖例高倍擴增無擴增擴增無擴增DNA序列測定的意義

DNA的序列測定是分子生物學研究中的一項非常重要的和關鍵的內容。如在基因的分離、定位、基因結構與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關系等等，都要求對DNA一級結構的詳細了解。桑格測序原理原理：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設立四種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導下，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。

13Sanger測序的流程結果解讀擴增阻礙突變系統(ARMS)-又稱等位基因特異性擴增（ASA），利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計等位基因特異性PCR擴增引物。ARMS（ASA）的特點是：“只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現PCR擴增帶，野生型的不擴增”優勢? 靈敏度高，重復性好，對標本突變率要求底? 操作簡單，儀器費用較低廉? 檢測時間短不足? 僅能檢測已知突變類型? 不能得到具體堿基突變類型ARMS法檢測16數字微滴PCR(ddPCR)通過將微量樣品擴大倍數稀釋和分液(partitioning)，直至每個樣品中所含有的待測分子數不會超過1個，再將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，并對發生了擴增反應的樣品逐個進行計數的一種技術。Copyright?2016.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.ddPCR的工作流程原理是在Sanger測序方法的基礎上，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP。通過堿基互補配對原則逐一的添加標記過的dNTP，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機識別、轉換，從而生成相應的序列信息。新一代高通量測序(NGS)的原理四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機

Miseq為首個FDA批準臨床的高通量測序儀

國際NGS高分文章，絕大多數使用Hiseq平臺18新一代高通量測序(NGS)能同時檢測不同形式的基因突變

MarcLadanyi.2015ASCOAnnualMeeting19檢測方法比較檢測方法優勢劣勢可檢測的變異形式AMRS-PCR1、靈敏度3%-10%2、擴增和檢測同時進行，封閉的體系，減少污染的可能性1、只能檢測已知突變2、如果檢測突變點或者類型較多，出現特異產物概率也增加3、當檢測位點較多時，對DNA樣本需求增加點突變、小片段插入/缺失無法測融合、大片段以及熱點測序熒光原位雜交FISH1、靈敏度高、特異度高2、空間定位準確，可同時分析分裂期和間期多個細胞，并進行定量1、通量低、成本高2、對操作和判讀技術要求高，不同讀片者判讀差異較大拷貝數變化、大片段插入/缺失、融合/重排。擴增的金標準免疫組化IHC1、可對組織和細胞中相應的抗原進行定性、定位及定量研究2、經濟快捷1、抗體的選擇2、檢測者組織的固定3、觀察者解釋方面的差異僅檢測蛋白表達水平Sanger測序1、測序長度2、準確性高，靈敏度20%-30%3、能處理的處理重復序列和多聚序列1、通量低、成本高2、對樣本中腫瘤細胞的含量和比例要求較高3、靈敏度低點突變、小片段插入/缺失二代測序1、大規模、高通量2、能檢測各種變異形式3、靈敏度1%-3%1、成本較高2、引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率，并且具有系統的偏向性，同時讀長也比較短3、對數據注釋和報告解讀要求高點突變擴增融合/重排插入/缺失20各種方法檢測的對比方法檢測層面樣本需求優勢劣勢IHCProtein組織直接展現表達結果，直觀主觀判斷，對操作人員要求較高，陽性判定不確定ARMSDNA組織，血液速度快，精準度較高無法測融合，擴增及大片段測序，熱點測序ddPCRDNA組織，血液單位點精準度非常高，可以進行動態監測多位點血檢匹配度不高，熱點測序FISHDNA組織擴增是金標準，并且可以測融合主觀判斷，對操作人員要求較高，對融合的判別要求非常高，結果容易出錯世和DNA/RNA普適性一次檢測所有突變類型，多基因，精準度高價格略高，周期略長21總結

SummaryNGS只需要微量樣本就可以一次性檢測所有的突變類型FISH做擴增與融合對實驗室研判人員的要求較高，NGS通過優化算法，降低人工出錯的比率。陰性對照極為重要，具有質控和探查種系突變的作用ARMS,ddPCR等傳統一代測序方法在熱點測序這一塊的確精準度較高，但是本質上仍舊是熱點測序，不能滿足越來越大的檢測需求世和專有探針庫保證了前期提取的DNA質量22NGS&ctDNA技術優勢NGS技術特點及優勢檢測全面精準度高周期短樣本需求少全自動化的大數據分析方法時時更新的醫學數據庫高通量單次檢測中同時發現多個基因的多種突變包括單堿基突變、堿基缺失、堿基插入和基因融合單次反應只能針對一種突變進行檢測，并只能檢測一種突變類型同時對416個致癌基因進行測序展現所有突變每次反應只檢測單個基因一種突變世和的技術在單次檢測中對每個堿基覆蓋600次以上，杜絕假陽/陰性結果技術局限，假陽/陰性錯誤率高只需一次微量

腫瘤樣本，并且可以檢測手術樣本，血液/積液樣本，FFPE石蠟樣本等多次檢測導致樣本量大、價格高、耗時長實現數據分析的算法優化和分析自動化，快速處理海量病人數據，杜絕人為錯誤技術局限無法及時有效處理海量病人數據以FDA逾三萬份臨床數據為基礎，報告切實有用，有效幫助醫生和病人選擇高敏感性的藥物不同實驗室的各種報告而造成的信息重復或混亂，無法保證臨床數據庫的完善性和時效性檢測流程高度自動化，7天提供全面準確報告多次反復測試，造成耗時長，而且由于技術局限無法提供全面的報告上一代傳統基因檢測高通量測序NGS與液體活檢結合可有效解決傳統檢測面臨的挑戰ctDNA液體活檢?特點和優勢26克服腫瘤異質性與組織高度匹配取樣無創簡便動態監測藥物療效動態監測耐藥情況有效評估預后NatRevClinOncol.2013Aug;10(8):472-84.沒有組織怎么辦？？？初始診斷性活檢是通過組織病理學、免疫組化和分子學特征描繪進行評估的，根據結果制訂治療方案在獲得性耐藥時進行再活檢，并采用同樣的方法重新分析以發現耐藥時收集的標本與治療前標本的差異該過程在各治療階段時重復進行應形成可能的細胞株和患者衍生的移植瘤模型以促進耐藥機制和治療作用的功能性研究PolitiK,etal.ClinCancerRes.2015May15;21(10):2213-20.分子學特征和再活檢與癌癥治療的整合27檢測全面?克服腫瘤異質性腫瘤具有復雜的時空異質性不同位置具有不同病灶腫瘤亞克隆AndriyMarusyk,etal.NatureReviewCancer.2012.AlmendroV,etal.Annualreviewofpathology2013.由于組織檢測只取樣于腫瘤的某一部位，無法衡量腫瘤組織的異質性，導致檢測信息不全面。ctDNA：由于ctDNA來源于患者體內不同位置的腫瘤細胞，同時經過人體天然血液循環系統混勻，其攜帶的腫瘤基因信息更全面，規避了腫瘤組織的異質性。靈敏度高?準確度高?假陽性率低Zhengetal.SciRep

6:

20913(2016).Thierryetal.NatMed.2014;

20(4):319-449.為什么要進行ctDNA基因檢測現有的基于血清蛋白生物標記物（例如CA-125和PSA）的無創檢測方法存在一定數量的假陽性與假陰性結果，并不能對腫瘤的進展做出準確判斷ctDNA可從血液中較易分離（liquid

biopsy），并攜帶腫瘤特異性的體細胞突變，因此極為適合作為腫瘤無創診斷及監測的生物標記物對ctDNA進行基因檢測還可以及時發現腫瘤復發后產生的抗藥性突變，而及時對治療方案進行調整盡管腫瘤本身是腫瘤DNA的最直接來源，但是通過活檢或手術獲取腫瘤組織是侵入性的，具有一定風險的。而且有些癌癥病人不宜進行手術，無法獲得腫瘤組織進行基因檢測，以幫助制定治療方案30ctDNA檢測中遇到的問題及挑戰

ctDNA總量取決于：樣品提供人的健康狀態取血及保存運輸血液/血漿樣品的條件血漿的制備方法DNA的提取方法以及DNA的定量方法世和基因的技術優勢：大幅提高ctDNA回收率從微量ctDNA建立測序文庫ctDNA在血液中含量極少，片段較小，提取方法及其重要1建庫及富集的產量2事實上，ctDNA檢測的核心在于前期準備以確保ctDNA文庫的多樣性，保證被檢測樣本有代表性是下游測序及分析的基石31那么多公司，為什么選擇我們？

世和的優勢32世和的優勢來自于——步步優化，精益求精33世和的優勢來自于——步步優化，精益求精優勢在于每步優化！QC步驟34樣本收集－兩小時之內分離血漿收到血樣后2小時內分離血漿血漿多種運輸條件實驗室模擬不能輸在起跑線上！運輸全血至總部再分離血漿季節地域溫差大，影響質量直接影響檢出率世和基因其他公司SciTranslMed.Aug26,2015;7(302):302ra1332小時內收集血漿是臨床試驗、高分論文金標準！分離全血收集血漿，時間精至分鐘！35DNA提取I－血漿ctDNA－富集小片段ctDNA，去除干擾小片段含腫瘤特異突變大片段不含腫瘤特異突變血漿DNA經過大小片段分離有效富集小片段ctDNA！更豐富的起始原料世和基因數據36DNA提取II－石蠟組織－自主研發基于qPCR的樣本質控0.5率先使用熒光定量PCR法用于FFPE樣本質控自主設計引物，經過>8個參數計算模型，確保通過QC樣本測序質量避免交聯過于嚴重的石蠟樣本進入流程測序質量好測序質量差世和基因數據，基于100例臨床病人石蠟樣本測序結果37樣本建庫－不計成本的大量進口試劑優化上百種進口試劑反復搭配優化極大提升建庫效率38靶向富集I－基因捕獲探針Mass

spec質控單獨合成基因靶向富集－15000余個探針探針庫反復優化14次，歷時3年，保證每個基因每個外顯子覆蓋探針單個合成，Mass

Spec保證質量7項核心專利探針單獨合成質譜分析純化世和探針庫剪切探針庫芯片大規模合成芯片合成探針的缺點：大規模一次合成多個探針統一剪切探針的完整性等品質無任何保證大部分探針都不完整，導致基因捕獲效率大大降低芯片合成探針的缺點反復15000次39靶向富集II－為什么一定要“好”探針？什么是探針的均一性（Uniformity）？探針覆蓋不均一探針覆蓋均一ALK19內含子測序數據的重要參數，除了測序深度，還有探針均一程度換句話說，如果EGFR覆蓋3000X，而ALK只覆蓋300X，將會嚴重影響檢測敏感性檢測靈敏度是由覆蓋最低的基因決定的如不均一，等于沒測！40世和基因IlluminaHiseq4000/Miseq其他測序公司IlluminaNextseq500四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機Miseq為首個FDA批準臨床的高通量測序儀國際NGS高分文章，絕大多數使用Hiseq平臺二色熒光判別ATCG

LED照相機

準確率和靈敏度較差主要用于產前檢測上樣測序－Illumina

Hiseq4000/Miseq與國際接軌41數據分析