利用ITS序列鑒定真菌摘要：采用蘑菇提取的DNA及瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ITS1和ITS2為引物構成的PCR反應體系對目的DNA片段（ITS1區）進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行分析照相，測序。隨著核糖體RdnaITS序列分析技術在菌物研究中的應用，一些分類地位不明確、親緣關系不清楚的物種通過該技術得到了解決，一些重要的菌物遺傳信息的到闡明。關鍵詞：ITS序列酵母菌PCR菌種鑒定1材料與方法1.1材料與試劑：真菌組織（蘑菇）、菌絲體或孢子、氯仿-異戊醇（24：1）：現配現用。70%乙醇：用95%乙醇配制，現配現用。IOxTAE溶液：IL溶液中含Trisl.2114g,EDTA29.22g,用HC1調pH至8.0。1%瓊脂糖凝膠：取lg瓊脂糖溶于lOOmllxTAE溶液中，微波爐加熱至沸騰三次，CTAB溶液、異丙醇，雙蒸水，3MNaAc,PH5.220ug/RNaseA，特異性片段PCR擴增，ITS引物（f：ccgtaggtgaacctgcggr：tcctccgcttattgatatgc。1.2主要儀器與設備表一實驗中使用的主要儀器儀器名稱 型號 產地立式自控高壓蒸汽滅菌器LDZX-40SSI上海申安醫療器械廠數顯HH-4國華電器有限公司電泳儀DYY-12北京市六一儀器廠制冰機AF200PSC50RMSA生物安全柜HFsafe1200/C上海力申科學儀器有限公司電冰箱BCD-219D青島海爾股份有限公司Sigma咼速離心機3K30Germany電子精密天平HR-200上海精科天平酸度計DELTA302上海電子可調電爐101RF-3天津市泰斯特儀器有限公司雙層恒溫振蕩器THZ-9511K太倉市實驗設備廠紫外分析儀WD-9403c北京市六一儀器廠臺式常溫咼速離心機Centrifuge5415DGermany恒溫水浴鍋多型號Germany生化培養箱LRH-250上海一恒科技有限公司基因擴增儀Palm-CyelerAustralia電泳槽DYCZ-24A北京六一儀器廠1.3實驗方法：真菌基因組DNA的提取（1） CTAB溶液在65°C水浴中預熱（使用前加入1%巰基乙醇），取適量（2） 取適量蘑菇置于研缽中，加入液氮，用小杵磨制粉狀，研磨期間及時添加液氮防止高溫氧化。（3） 液氮中預冷小勺和離心管，取0.1-0.2g的研磨樣品放入1.5ml離心管中，加入700ul的CTAB溶液，輕輕攪拌搖勻，置于65C水浴中，每隔1Omin輕輕搖動，40min后取出。（4） 室溫冷卻2min，加入等體積Tris酚/氯仿/異戊醇溶液，顛倒混勻抽提15-20分鐘。（5） 小心吸取上清液約500ml，加入等體積異丙醇顛倒混和（此刻能見到DNA絮狀物）（6） lOOOOrpm,離心10min,倒掉液體，留下沉淀。（7） 加入1ml70%的乙醇洗滌DNA沉淀，lOOOOrpm,離心5min,倒掉液體，干燥DNA（超凈臺風干或自然風干）（8） 沉淀風干透亮后50ulTE緩沖液，使DNA溶解，置于-20c保存。真菌基因組DNA的檢測：⑴制備瓊脂糖凝膠：將10XTAE貯存液用蒸餾水稀釋成1XTAE電泳緩沖液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加入對應量1XTAE稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水份蒸發，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復3次，至瓊脂糖全部熔化，放置，待其稍冷卻。⑵膠板的制備：將制膠槽置于水平支持物上，選擇合適厚度和齒數的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60C的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（EB）溶液數滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心撥出梳子，將膠塊取出，置于已加入足量1XTAE電泳緩沖液得電泳槽內。⑶加樣：取20卩lDNA樣品與2卩l6X加樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中，在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內加入5ul的100bpDNAladder。⑷電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm（約100V）電泳，當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。⑸成像：戴上一次性手套，在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統照相。PCR擴增：ITS引物(F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATG)PCR擴增產物的檢測，采用瓊脂糖凝膠電泳系統檢測同上。ITS片段的測序：將PCR擴增產物郵寄至測序公司，由測序公司完成測序。BLAST比對、鑒定屬、種：登錄NCBI主頁-點擊BLAST-點擊Nucleotide-nucleotideBLAST在Search文本框中粘貼檢測序列-點擊BLAST-點擊Format-得到resultofBLAST。圖片不是很清晰，由于在處理過程中沒有及時記下順序，所以對于上圖就無法清楚準確的進行分析，這是一個失誤。圖片中能見到有一條條亮的是“Mark”共有1200、900、700、500、300、150、100、50bp等8類DNA片段，根據原圖對比，本次實驗只可以檢測到1200、900、700、500、300、100bp等6類DNA片段。圖片中基因組DNA破損片段較小。2.2ITS測序結果TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGRCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA3討論由圖一可知，所提取出來的基因組DNA片段比較小，具體原因可能如下：在DNA提取步驟中，時間可能過長，是DNA斷裂較為厲害；在用氯仿異戊醇抽提蛋白質時，要劇烈搖動10min,這樣的步驟也許會使DNA斷裂；再者，使用高速離心機，其轉速達到lOOOOrpm,也可以使DNA斷裂。Mark理論條帶為8條，實際只有6條，可能原因為Mark量太少，上樣時只用了