無癥狀淋球菌感染的機制探討第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五4/10/2023

留學經歷2010.4-2011.3日本九州大學醫(yī)學院皮膚科導師：古江增隆教授2010年第一屆東亞皮膚科學會籌備，古江教授為大會主席2011.3-2014.3美國哈佛醫(yī)學院麻省總醫(yī)院皮膚科/皮膚生物學研究中心導師：DavidE.Fisher教授皮膚科/皮膚生物學研究中心主任、黑素瘤學會主席24/10/2023第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五3國家自然科學基金面上項目《性激素調控Opa-CEACAMs分子通路在女性無癥狀感染淋病中致病機制研究》項目編號：81171626主持人：涂亞庭國家自然科學基金面上項目《DGI株毒力島altA與sac-4基因對淋球菌毒力作用的分子機制研究》項目編號：30700717主持人：陳宏翔

國家自然科學基金面上項目《mtr系統在淋球菌耐藥中作用及其干預研究》項目編號：30371293主持人：涂亞庭教育部博士學科點專項科研基金（新教師基金課題）《淋球菌DGI株毒力島基因的鑒定及外源指導序列干預研究》項目編號：20070487140主持人：陳宏翔華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院研究基金《淋球菌毒力島的鑒定及EGS干預研究》主持人：陳宏翔4/10/20233第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五4

淋病是我國流行性病中的主要病種淋球菌的革蘭氏染色淋球菌燭缸培養(yǎng)淋球菌菌落4/10/2023第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五女性無癥狀感染淋病（asymptomaticgonorrhea，AG）與男性患者產生明顯的大量黃白色或黃綠色黏稠膿液癥狀不同，50%-80%的女性感染后無癥狀或無明顯主觀癥狀，即無癥狀感染淋病或稱無明顯癥狀感染淋病。女性無癥狀感染淋病易導致多種嚴重的婦科合并癥。無癥狀女性在感染淋球菌的初期，通常不會積極采取任何有效治療措施，淋球菌易由下生殖道發(fā)展為上行顯性感染，導致極為嚴重的后果，例如，盆腔炎，不孕，輸卵管阻塞，異位妊娠，播散性淋病等。衣原體和淋球菌無癥狀感染者感染HIV的危險性會增加3－6倍。。女性無癥狀感染淋病極有可能是淋病在人群中蔓延的最大元兇！54/10/2023第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五6營養(yǎng)分型、血清學分型營養(yǎng)/血清學雙重分型脈沖場凝膠電泳技術隨機擴增多態(tài)DNAopa分型NG-MAST分型(Por和tbpB)一個新的基因組島稱為GGI(gonococcalgeneticisland，GGI)，進一步研究發(fā)現在57kb大小的GGI毒力島中18個開放讀碼框架編碼IV型分泌系統（typeIVsecretionsystemT4SS)，淋球菌表面抗原變異和其它毒力、耐藥信息可能是通過IV型分泌系統以轉化的方式來傳遞給周圍受體菌的。

分子分型毒力島4/10/2023第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五7第一部分

淋球菌的基因分型、毒力島分類及與女性無癥狀感染關系的研究

第二部分

衣原體感染、性激素水平等因素與女性無癥狀感染關系的研究第三部分

孕激素體外調節(jié)Ngo-PMNs炎癥反應的作用機制研究第四部分

孕激素體外調節(jié)Ngo-PMNs呼吸爆發(fā)、凋亡應答的機制研究第五部分淋球菌生殖道感染小鼠模型中孕激素對Th17/Treg細胞的作用第六部分性激素通過Opa-CEACAMs分子通路對Th2、Th17細胞進行調控。。。。。。4/10/2023第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五8

第一部分

淋球菌的基因分型、毒力島分類及與女性無癥狀感染淋病關系的研究

4/10/2023第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五9目的評價Opa分型及NG-MAST對淋球菌分離株進行基因分型的能力及性伴侶分離淋球菌基因型別之間的關系，研究淋球菌不同基因型別的毒力島類型及其所引起女性無癥狀感染關系。方法

12對性接觸者淋球菌分離株培養(yǎng)鑒定后Opa基因以HpaII酶切及聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色分析；12株男性標本和81株女性標本PCR擴增por和tbpB后測序用NG-MAST方法從分子水平上進行基因分型，并用ClustalX軟件做進化樹分析；并對毒力島分類與女性無癥狀感染關系進行了研究。4/10/2023第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五10淋球菌株進化樹分析4/10/2023第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五11

淋球菌株基因以HpaII酶切后聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色分析4/10/2023第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五12結果

12對性接觸患者分離株中，NG-MAST區(qū)分出10種ST型，而使用Opa分型則呈現12種OT型；新發(fā)現的ST(217-679)是國內特有的流行株。武漢地區(qū)女性感染的81株野生株中，GGI陽性菌株占了64株（80.43%)；無癥狀組有GGI陽性株也有GGI陰性株，有癥狀組也是如此。結論患者-性伴組除了45/46之外每對菌株的ST型及OT型均相同,表明患者與性伴相互接觸傳染。Opa-typing及NG-MAST可區(qū)分性關系網中的淋球菌菌株，二種方法分型結果總的趨向一致。Opa分型能力高于NG-MAST，ST型別可進一步的分成opa-types(OT)亞型。GGI毒力島與女性癥狀感染之間并無明顯的相關性，即女性有膿性分泌物感染并不是感染了強毒力的菌株所致。4/10/2023第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五13

第二部分

衣原體感染、性激素水平等因素與女性無癥狀感染淋病關系的研究4/10/2023第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五14目的探討女性淋球菌感染癥狀與衣原體感染及體內性激素水平等因素之間的關系。方法選擇136例無明顯癥狀女性淋病患者為觀察組，45例有癥狀者為對照組，檢測宮頸分泌物衣原體及淋球菌DNA；放射免疫法測定E2和P濃度；用RT-PCR和ELISA的方法在mRNA水平和蛋白水平檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達。4/10/2023第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五157例分泌物標本淋球菌16SrRNA、cppB基因和衣原體omp1基因PCR結果4/10/2023第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五16不同感染組宮頸分泌物TNF-α、IL-1βmRNA的檢測A:IL-1β和β-actinRT-PCR產物電泳結果；B:TNF-α和β-actinRT-PCR產物電泳結果C:IL-1β和β-actin條帶光密度分析結果；D:TNF-α和β-actin條帶光密度分析結果4/10/2023第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五174/10/2023第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五18結果淋病的無明顯癥狀感染與衣原體感染無顯著相關性，但其炎癥因子TNF-α、IL-1β減少與血清孕激素水平升高的相關性具有統計學意義。

結論女性淋病患者體內孕激素水平的增高可能是導致無癥狀感染的重要原因。4/10/2023第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五19

第三部分

孕激素體外調節(jié)Ngo-PMNs炎癥反應的作用機制研究4/10/2023第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五20目的選擇了有癥狀組和無癥狀組的非獨特NG-MAST亞型各3種菌株，進一步研究孕激素在這些淋球菌野生株引起的中性粒細胞炎癥反應的調節(jié)作用，探討其作用差異及信號轉導的可能機制。方法分離人外周血中性粒細胞（PMNs），檢測PMNs上PR的表達：在孕激素作用的不同時段檢測iNOS,eNOS,TNF-a和IL-1β的mRNA變化，測定iNOS、eNOS、Akt和p-Akt(Ser473)蛋白水平，比較分析其差異。4/10/2023第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五214/10/2023第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五224/10/2023第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五23結果我們通過RT-PCR和免疫熒光的方法發(fā)現人的外周中性粒細胞并不表達經典的PR受體；孕激素能抑制iNOS,TNF-a和IL-1β的mRNA表達，在有癥狀組NgoST2951、ST735、ST436和無癥狀組ST809、ST369、ST2948中并沒有顯著差別；孕激素顯著下調了iNOS蛋白的表達水平，然而eNOS蛋白沒有檢測到顯著的改變；在孕激素處理前后沒有能觀察到磷酸化的Akt蛋白，總的Akt也沒有改變。結論孕激素的壓力導致PMNs中加劇iNOS表達的抑制和PMNs前炎癥因子的下調，而這種作用是不依賴于PR介導受體途徑和akt信號通路。4/10/2023第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五24

第四部分

孕激素體外調節(jié)Ngo-PMNs呼吸爆發(fā)、凋亡應答的機制研究4/10/2023第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五25目的研究孕激素體外調節(jié)淋球菌引起的中性粒細胞呼吸爆發(fā)和凋亡的作用。方法分離人外周血中性粒細胞，分別用孕激素和十字孢堿處理，十字孢堿作為陽性對照。在0，3，8，12小時等時段用熒光定量RT-PCR分別測定各組中性粒細胞中凋亡抑制蛋白cIAP2和XIAP的表達水平；同時用流式細胞儀檢測PMNs凋亡，用魯米諾化學發(fā)光法檢測淋球菌ST2951株刺激PMNs后呼吸爆發(fā)。4/10/2023第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五26Figure1EffectofprogesteroneonexpressionsofIAPswereanalyzedbyreal-timePCR.4/10/2023第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五27Table1ProgesteronedelayedtheonsetofapoptosisinNgochallengedPMNs.4/10/2023第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五28Figure

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AnnexinV-FITC?PImethodfordetectionofapoptosisinNgochallengedPMNsat12h.4/10/2023第28頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五29Figure3Chemiluminescence.AdherentPMNwerechallengedinthepresenceofluminolwithstaurosporine(●)orwithprogesterone(▲),Medium+ST2951(○)wereusedasanegativecontrol.Chemiluminescencereadingsweretakenevery5minfor1h.4/10/2023第29頁，共30頁，2023年，2月20日，星期五30結果

cIAP2在孕激素處理3h后顯著上調而XIAP和ST