基因結構及基因組學植物基因工程1第1頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四第一節基因結構與功能2第2頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四什么是基因？孟德爾在1866年發表的《植物雜交的試驗》一文中提出了“遺傳因子”的概念。1909年，丹麥人約翰遜將孟德爾文章中的遺傳因子稱為基因，于是，基因的概念便成了遺傳學中的一個基本概念。1910年，美國人摩爾根發表了關于果蠅性連鎖遺傳的論文，將一個基因和一個具體的染色體的行為聯系起來。DNA是遺傳物質。DNA堿基的突變導致表型的改變。基因的本質就是DNA第3頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因的概念基因（遺傳因子）是遺傳的基本單元，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列。基因通過復制把遺傳信息傳遞給下一代，使后代出現與親代相似的性狀。基因儲存著生命孕育、生長、凋亡過程的全部信息，通過復制、轉錄、表達，完成生命繁衍、細胞分裂和蛋白質合成等重要生理過程。生物體的生、長、病、老、死等一切生命現象都與基因有關。它也是決定生命健康的內在因素。因此，基因具有雙重屬性：物質性（存在方式）和信息性（根本屬性）。第4頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因的概念（1）基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遺傳效應的核苷酸序列，是遺傳的基本單位。（2）基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。（3）對于編碼蛋白質的結構基因來說，基因是決定一條多肽鏈的DNA片段。第5頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四根據是否具有轉錄和翻譯功能可以分為三類第一類是編碼蛋白質的基因，它具有轉錄和翻譯功能，包括編碼酶和結構蛋白的結構基因以及編碼阻遏蛋白的調節基因第二類是只有轉錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因第三類是不轉錄的基因，它對基因表達起調節控制作用，包括啟動基因和操縱基因第6頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四原核細胞真核細胞第7頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四原核生物無細胞核，染色體散在細胞質的核區中。一般只有一個染色體，即一個DNA或RNA分子，Gene

是連續的。大多數是雙鏈環狀，少數為單鏈、線狀；如：大腸桿菌，雙鏈環狀DNA分子，3000~4000個基因，4.2x106bp,已經定位900多個基因（一）原核與真核生物基因比較第8頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四真核生物有細胞核，染色體存在于細胞核中。Gene結構復雜，斷裂基因，3～4萬個Gene；Gene大小差別很大。β珠蛋白基因（1700bp）=3個外顯子+2個內含子。DMD基因（2300kb）79個外顯子，

78個內含子。（迄今認識的最大的基因）第9頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四1、外顯子和內含子在結構基因中，編碼序列稱為外顯子(exon)，表達多肽鏈部分。非編碼序列稱為內含子(Intron)，又稱插入序列。β珠蛋白基因（1700bp）=3個外顯子+2個內含子。DMD基因（2300kb）=79個外顯子+78個內含子。（迄今認識的最大的基因）真核生物內含子和外顯子不是完全固定不變的，有時同一DNA鏈上的某一段DNA序列，當它作為編碼某一多肽鏈的基因時是外顯子，而作為編碼另一多肽鏈時，則是內含子。這樣，同一基因卻可以轉錄兩種或兩種以上的mRNA。真核生物某些結構Gene沒有內含子，如組蛋白Gene，干擾素Gene等。它們多以基因簇形式存在，大多數的酵母結構Gene也沒有內含子。10第10頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四hnRNA:heterogeneousRNA11第11頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四5`GT——AG3`法則

在每個外顯子和內含子的接頭區都是一段高度保守的共有序列，內含子的5`端是GT，3端是AG，這種接頭方式稱為GT-AG法則，普遍存在于真核生物中，是RNA剪接的識別信號，轉錄后的前體RAN中的內含子剪接位點。12第12頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四13第13頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2、側翼序列與調控序列

每個結構基因的第一個和最后一個外顯子的外側，都有一段不被轉錄的非編碼區，稱為側翼序列（Flankingsequence）。它是基因的調控序列，對基因的有效表達起調控作用，包括：啟動子、增強子、終止子等。14第14頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.1啟動子

啟動子（

Promoter）是一段特定的核苷酸序列，位于Gene轉錄起始點上游的100bp范圍內，是RNA聚合酶的結合部位，能促進轉錄過程。Promoter決定DNA中的轉錄鏈。TATA框（TATABox）是一段高度保守序列（TATAA），位于轉錄起始點上游-25～-30bp（原核生物-10區）。TATA框與轉錄因子TFII結合，再與RNA聚合酶II形成復合物，從而準確地識別轉錄起始位置，對轉錄水平有定量效應。。15第15頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四CAAT框（CAATBox）:是一段保守序列（CCAAT），位于轉錄起始點上游-70～-80bp（原核生物-35區）,轉錄因子CTF識別位點并與之結合，激活轉錄。GC框（GCBox）:順序為GGCGGG,有兩個拷貝，位于CAATBox兩側，與轉錄因子SP1結合。（SP1有鋅指區可以與DNA結合，在N端有激活轉錄的作用）GC框有激活轉錄的功能。16第16頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四17第17頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四18第18頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.2增強子增強子（Enhancer）能強化轉錄起始的一段DNA序列。1981年Benerji在SV40噬菌體DNA中發現一個140bp的序列，它能大大提高SV40DNA/兔β—血紅蛋白融合基因的表達水平，這是發現的第一個增強子。它位于SV40早期基因的上游，由兩個正向重復序列組成，每個長72bp。目前發現的增強子多半是重復序列，一般長50bp，通常有一個8—12bp組成的“核心”序列，如SV40增強子的核心序列是5’—GGTGTGGAAAG—3’。19第19頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四特點：在任意位置都有效——增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常可距離1－4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。無方向性——增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。有組織特異性——例如：Beta珠蛋白Gene增強子是由串聯重復的兩個72bp長的相同序列組成，位于轉錄起點上游-1400bp或下游3300bp處，均可增強轉錄效率（活性）200倍。增強子在轉錄起始點的上下游一定范圍內增強轉錄效率。作用可以是5’～3’，也可以是3’～5’方向。20第20頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.3終止子終止子（Terminator）由一段回文序列以及特定的序列（PolyA）5’--AATAAA--3’組成。回文序列為轉錄終止號。PolyA為附加信號。終止子為反向重復序列，是RNA聚合酶停止工作的信號，反向重復序列轉錄后，可以形成發夾式結構，并且形成一串U。發夾式結構阻礙了RNA聚合酶的移動。一串U的U與DNA模板中的A的結合不穩定，從模板上脫落下來，終止轉錄。21第21頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四調控序列（RegulatorSequence）包括啟動子，增強子和終止子均屬于基因的順式調控因子（順式作用元件），是人類Gene組中的一些特殊序列，起調控基因表達的作用。反式作用因子：是指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質，如TFII、CTF、SP1等。2.4順式作用原件和反式作用因子因子22第22頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四第二節基因組第23頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因組中不同的區域具有不同的功能有些區域編碼蛋白質的結構基因有些區域是復制及轉錄的調控信號有些區域的功能尚不清楚基因組（genome）：單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。第24頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四Winkler在1920年首次提出基因組（genome）一詞，意為gene與chromosome的組合。目前在不同的學科中，對基因組含義的表述有所不同，概括為如下：①從細胞遺傳學的角度來看，基因組是指一個生物物種單倍體的所有染色體數目的總和；②從經典遺傳學的角度來看，基因組是一個生物物種的所有基因的總和；③從分子遺傳學的角度來看，基因組是一個生物物種所有的不同核酸分子的總和；④從現代生物學的角度來看，基因組是指導一個生物物種的結構和功能的所有遺傳信息的總和，包括全部的基因和調控元件等核酸分子。第25頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四1.基因組較小，通常只有一個環形或線形的DNA分子；2.通常只有一個DNA復制起點；3.非編碼區主要是調控序列；4.基因密度非常高，基因組中編碼區大于非編碼區；5.結構基因沒有內含子，多為單拷貝，結構基因無重疊現象；6.重復序列很少，重復片段為轉座子；7.基因組的大部分序列是用來編碼蛋白質的，基因之間的間隔序列很短；8.功能相關的序列常串連在一起，由共同的調控元件調控，并轉錄成同一mRNA分子，可指導多種蛋白質的合成，這種結構稱操縱子。原核生物基因組特點第26頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四1.基因組較大。真核生物的基因組由多條線形的染色體構成，每條染色體有一個線形的DNA分子，每個DNA分子有多個復制起點；2.不存在操縱子結構。真核生物的同一個基因簇的基因，不會像原核生物的操縱子結構那樣，轉錄到同一個mRNA上；3.存在大量的重復序列。真核生物的基因組里存在大量重復序列，通過其重復程度可將其分成高度重復序列、中度重復序列、低度重復序列和單一序列；4.有斷裂基因。大多數真核生物為蛋白質編碼的基因都含有“居間序列”，即不為多肽編碼，其轉錄產物在mRNA前體的加工過程中被切除的成分；5.真核生物基因轉錄產物為單順反子；6.功能相關基因構成各種基因家族。真核生物基因組特點第27頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四核基因組——是單倍體細胞核內的全部DNA分子；線粒體基因組——線粒體所包含的全部DNA分子（雙鏈環狀，少數線狀）；葉綠體基因組——則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子（雙鏈環狀）。植物基因組第28頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四（1）C值矛盾C值通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。ThetotalamountofDNAinthegenomeofhaploidisacharacteristicofeachlivingspeciesknownasitsMaximumCvalue

(單倍體基因組總DNA的含量)

最大C值(MaximumCvalue)ThetotalamountofDNAforencodingthegenesinformationistermeditsMinimumcvalue（編碼基因信息的總DNA含量）

最小C值(Minimumcvalue)第29頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四霉菌藻類G+細菌G-細菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類棘皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌支原體A生物體進化程度與大

C值不成明顯正相關B親緣關系相近的生物間大C值相差較大

C一種生物內大C值與小c值相差極大（人體c=C/10）

第30頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四，內含子、啟動子第31頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四遺傳圖譜：以遺傳學距離（cM，即每次減數分裂的重組頻率為1%）為圖距的基因組圖。（2）基因組的四大圖譜物理圖譜：物理圖譜描繪DNA上可以識別的標記的位置和相互之間的距離（以堿基對的數目為衡量單位）。序列圖譜：通過測序得到基因組的序列圖譜轉錄圖譜：是在識別基因組所包含的蛋白質編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。第32頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四球形芽孢桿菌C3-41菌株34第34頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四（3）線粒體基因組和葉綠體基因組大多數細胞器DNA是閉合環狀的。1）線粒體的基因組(mtDNA)脯乳動物的mtDNA為16.5Kb2）葉綠體的基因組(cpDNA)植物特有，大約121-155Kb第35頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四（4）基因家族1）基因家族（genefamily）：真核生物基因組中來源相同，結構和功能相關的基因聚集在一起形成基因家族。根據分布形式分基因簇和散布的基因家族：基因簇（genecluster）基因家族的各個成員緊密成簇排列成大段的串聯重復單位，分布在某一條染色體的特殊區域；它們可同時發揮作用，合成某些蛋白質。如組蛋白基因家族聚集在第7號染色體長臂3區內。組蛋白基因家族第36頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四第三節基因結構預測與功能注釋第37頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因組序列cDNA序列編碼區預測CodonbiasGCContent限制性酶切位點基因結構分析選擇性剪切轉錄調控因子序列比對功能注釋KEGGGO系統發育樹蛋白質序列翻譯蛋白質理化性質二級結構預測結構域分析重要信號位點分析三級結構預測（1）基因組功能分析第38頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四（2）植物基因的主要結構特征第39頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四40基因結構分析常用軟件開放讀碼框GENSCANGENOMESCANCpG島CpGPlot啟動子/轉錄起始位點PromoterScan轉錄終止信號POLYAH密碼子偏好分析CodonWmRNA剪切位點NETGENE2Spidey選擇性剪切ASTD（3）基因結構分析第40頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四1、開放閱讀框的識別開放閱讀框（openreadingframe,ORF)

是一段起始密碼子和終止密碼子之間的堿基序列ORF是潛在的蛋白質編碼區第41頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四42基因開放閱讀框/基因結構分析識別工具ORFFinder/gorf/gorf.htmlNCBI通用BestORF/berry.phtml?topic=bestorf&group=programs&subgroup=gfindSoftberry真核GENSCAN/GENSCAN.htmlMIT脊椎、擬南芥、玉米GeneFinder/tools/genefinder/Zhanglab人、小鼠、擬南芥、酵母FGENESH/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfindSoftberry真核(基因結構)GeneMark/GeneMark/eukhmm.cgiGIT原核GLIMMER/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi/software/glimmer

Maryland原核Fgenes/berry.phtml?topic=fgenes&group=programs&subgroup=gfindSoftberry人（基因結構）FgeneSV/berry.phtml?topic=virus&group=programs&subgroup=gfindvSoftberry病毒Generation/generation/ORNL原核FGENESB/berry.phtml?topic=fgenesb&group=programs&subgroup=gfindbSoftberry細菌（基因結構）GenomeScan

/genomescan.html

MIT脊椎、擬南芥、玉米GeneWise2http://www.ebi.ac.uk/Wise2/EBI人GRAIL/grailexp/ORNL人、小鼠、擬南芥、果蠅第42頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四43ORF識別：GENSCAN/GENSCAN.html結果返回到郵箱（可選）提交序列提交序列文件運行GENSCAN顯示氨基酸或CDS序列序列名稱（可選）是否顯示非最優外顯子選擇物種類型第43頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2、轉錄調控序列分析

CpG島、啟動子和轉錄終止信號區域的預測第44頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四CpG島的預測CpG島常位于真核生物基因轉錄起始位點，GC含量>50%，長度>200bp的一段DNA序列。第45頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四46CpGIsland分析常用軟件CpGIsland/cpgislands2/cpg.aspxWebCpGPlothttp://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.htmlWebCpGfinder/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoterWebCpGi130/CpG130.dowebCpGproDhttp://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.htmlweb第46頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四提交序列文件提交序列參數選項CpG島的預測：CpGPlothttp://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html第47頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四啟動子區結構啟動子（Promoter）

位于結構基因5’端上游，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA結合并具有轉錄起始的特異性轉錄起始位點(Transcriptionstartsite,TSS)PYCAPY（嘧啶）核心啟動子元件(Corepromoterelement)TATAbox，Pribnowbox

（TATAA)上游啟動子元件(Upstreampromoterelement，UPE)CAATbox，GCbox，SP1，Otc增強子(Enhancer)PyCAPyTATAATGC區CAAT區mRNA＋1－40－25－110增強子上游啟動子元件，UPE核心啟動子元件轉錄起始位點第48頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四PromoterScan/molbio/proscan/WebPromoser/zlab/PromoSer/WebNeuralNetworkPromoterPrediction/seq_tools/promoter.htmlWebSoftberry:BPROM,TSSP,TSSG,TSSW/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoterWebMatInspectorhttp://www.gene-regulation.de/WebRSAThttp://rsat.ulb.ac.be/rsat/WebCister/~mfrith/cister.shtmlWeb啟動子結合位點分析常用軟件第49頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四啟動子預測：PromoterScan/molbio/proscan/提交序列第50頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四PromoterScan輸出結果找到的TATAbox和轉錄起始位點預測可能的轉錄因子轉錄因子在提交序列中的位置第51頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四轉錄終止信號上游作用元件：AAUAAA下游作用元件：GCrich二重對稱區、UUUUUUAAUAAACAAAAAAAAAAAAA成熟mRNA5’3’AAUAAACAGUmRNA前體5’3’第52頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四轉錄終止信號預測：POLYAH/berry.phtml?topic=polyah&group=programs&subgroup=promoter

提交序列文件提交序列第53頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四polyA位置POLYAH輸出結果第54頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因密碼子偏好性第55頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四561.研究蛋白質結構功能中的作用2.在表達外源基因方面的作用3.在生物信息學研究中的作用第56頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四基因密碼子偏好性:CodonW粘帖目的序列密碼子表的選擇如需計算FOP/CBI選擇相應物種如需計算CAI選擇相應物種http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=codonw第57頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四參數選擇計算所有指數計算有效密碼子數計算GC含量計算GC3s含量計算同義密碼子數量計算同義密碼子第三位堿基組成密碼子總數第58頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四59密碼子使用頻率CodonW結果界面第59頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四內含子/外顯子剪接位點識別如何分析核酸序列中的外顯子組成？通過對特征序列(GT-AG)的分析進行直接的預測基因預測軟件（NetGene2）與相應的基因組序列比對，分析比對片段的分布位置（Spidey）第60頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/提交序列選擇物種內含子/外顯子剪接位點識別：NetGene2第61頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四NetGene2輸出結果供體位點受體位點可信度

相位第62頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四mRNA剪接位點識別：SpideyNCBI開發的在線匹配程序用于mRNA序列同基因組序列比對分析/spidey第63頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四Spidey同源序列的獲得:序列比對通過BLAST進行序列比對，找到可能同源的相似性好的一系列mRNA序列。BLAST比對到的三條mRNA序列第64頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四輸入基因組序列或序列數據庫號輸入相似性序列判斷用于分析的序列間的差異，并調整比對參數不受默認內含子長度限制。默認長度：內部內含子為35kb,末端內含子為100kb比對閾值選擇物種輸出格式選擇第65頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四66Spidey輸出結果第一條藍色序列為基因組序列，橘黃色為外顯子外顯子對應于基因組上的起始/結束位置外顯子對應于mRNA/cDNA上的起始/結束位置供體、受體位點外顯子長度一致性百分比錯配和gap外顯子序號序列聯配結果第66頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四可能的選擇性剪切體GENSCAN與Spidey結果比較第67頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四可變剪接（Alternativesplicing）分析可變剪接是調控基因表達的重要機制了解不同物種、細胞、發育階段、環境壓力下基因的調控表達機制第68頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四可變剪接的類型第69頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四70查詢可變剪接相關的網站http://www.ebi.ac.uk/astd/main.html綜合http://splicenest.molgen.mpg.de/綜合/new_alt_exon_db2/綜合.tw/.au/altExtron人/~kent/intronerator/altsplice.html線蟲/tdb/e2k1/ath1/altsplicing/splicing_variations.shtml擬南芥從已知基因的功能推測剪接機制第70頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四選擇性剪接查詢：ASTD數據庫

http://www.ebi.ac.uk/astd/main.html

輸入基因名稱選擇物種類型第71頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四ASTD數據庫檢索結果：基因描述信息

導出序列文件第72頁，共82