實驗十二微絲觀察熒光探針標記第1頁/共9頁實驗十二微絲的觀察

（熒光探針標記）第2頁/共9頁一實驗目的1學會使用細胞涂片機2掌握微絲顯示的方法3熟練使用熒光顯微鏡第3頁/共9頁二實驗原理Actin-TrackerGreen是一種Actin綠色熒光探針，可以用于培養細胞或組織切片的Actin特異性熒光染色。Actin-TrackerGreen探針為熒光染料FITC標記的毒蕈肽(phalloidin)，即phalloidin-FITC，其分子量約為1251.4，最大激發波長為496nm，最大發射波長為516nm。本產品可以用于細胞或組織內的微絲(microfilament)的熒光檢測。本產品使用時的推薦稀釋比例為1:200。如果每個片子需要使用200μl染色工作液，每個包裝的本產品足夠用于200個片子第4頁/共9頁三實驗步驟a.用PBS洗滌細胞或組織切片2次。或采用細胞涂片機離心涂片。b.用PBS配制的3.7%甲醛溶液室溫固定細胞或組織切片約10分鐘。注意：甲醇可以破壞actin蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。并且盡量使用不含甲醇的甲醛。c.用或含0.1%TritonX-100的PBS洗滌2-4次，每次約5分鐘。d.用含有2%BSA和0.1%TritonX-100的PBS按照1:200的比例稀釋Actin-TrackerGreen，例如5μlActin-TrackerGreen用1ml稀釋液稀釋，稀釋后的溶液即為Actin-TrackerGreen染色工作液。稀釋比例可以根據實際染色效果進行適當調整。e.把Actin-trackerGreen染色工作液按照每個片子約200μl的比例滴加到片子上，室溫避光孵育20-60分鐘。為防止蒸發，孵育時最好將片子置于載玻片染色盒中，載玻片染色盒(FSR958)可以訂購。第5頁/共9頁三實驗步驟f.用含0.1%TritonX-100的PBS洗2-4次，每次約5分鐘。g.蓋上蓋玻片隨后可以直接用熒光顯微鏡進行觀察。為長期保存，可以在片子自然干燥后封片并于4℃避光保存，保存時間可長達6個月左右。熒光顯微鏡下觀察結果，用綠光激發。第6頁/共9頁注意事項：1熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。2Phalloidin有一定毒性(LD50為2mg/kg)，1mlActin-TrackerGreen中的phalloidin少于0.01mg，使用時請注意適當防護。3為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4固各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落。

5用1%TritonX—100抽提雜蛋白要作預實驗，抽提時間長將破壞細胞結構，抽提時間短背景干擾大。

6鬼筆環肽標記微絲，染色時間勿太長，否則背景發紅。在沒有固定液3.7%甲醛—PEMD的情況下，也可以用-20℃冷甲醇代替，但是效果較差。7細胞充分貼壁鋪展時應力纖維較多，形態挺直。反之，細胞收縮變圓，應力纖維彎曲，甚至部分解聚消失而顯得稀少。8每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。第7頁/共9頁

四作業微絲觀察實驗中，1%Trito