細胞培養技術CellCulture病理（腎臟）實驗室白潔第一頁，共58頁。第一頁，共58頁。細胞培養概念：取動物組織，在體外，無菌條件下，模擬體內環境（營養、溫度、pH值、氣體），對其進行培養，使細胞能夠生存、生長、保持原來生物學特性的一種實驗方法。

第二頁，共58頁。第二頁，共58頁。內容細胞培養的基本條件細胞培養基本實驗第三頁，共58頁。第三頁，共58頁。一、細胞培養的基本條件實驗室條件：環境、設備、器材、試劑實驗操作者工作范疇：無菌操作、溫育、培養液配置、洗刷、無菌處理、細胞和用品儲存等

back第四頁，共58頁。第四頁，共58頁。實驗室條件

無菌環境

儀器設備普通器材

一般試劑第五頁，共58頁。第五頁，共58頁。

無菌室結構模式圖back

第六頁，共58頁。第六頁，共58頁。儀器設備

超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、液氮罐、低溫冰箱、重蒸水裝置、負壓真空泵、普通冰箱、消毒鍋、烤箱、水浴鍋、天平等

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第七頁，共58頁。第七頁，共58頁。二氧化碳培養箱

back第八頁，共58頁。第八頁，共58頁。超凈工作臺

back第九頁，共58頁。第九頁，共58頁。倒置顯微鏡back第十頁，共58頁。第十頁，共58頁。液氮罐back第十一頁，共58頁。第十一頁，共58頁。普通器材玻璃瓶皿：玻璃瓶、培養瓶、培養皿、吸管、離心管、抽慮瓶等塑料瓶皿：多孔培養板、培養皿、培養瓶等

第十二頁，共58頁。第十二頁，共58頁。back第十三頁，共58頁。第十三頁，共58頁。一般試劑

培養液

平衡鹽液消化液

抗生素液

pH調整液

back第十四頁，共58頁。第十四頁，共58頁。back第十五頁，共58頁。第十五頁，共58頁。培養液

使用培養液：天然培養基5-20%

合成培養基80-95%附加成分再加適量抗生素液，調整pH值即可

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第十六頁，共58頁。第十六頁，共58頁。天然培養基小牛血清胎牛血清組織提取液

back第十七頁，共58頁。第十七頁，共58頁。合成培養基RPMI1640Eagle培養液：DMEM、MEM、IMDMHamF12、HamF10、PC199Mc-Coy5A

back第十八頁，共58頁。第十八頁，共58頁。附加成分

促貼壁物：層粘連蛋白等激素：胰島素、氫化考的松、GH等生長因子：ECGF、NGF、FGF等酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制劑等

back第十九頁，共58頁。第十九頁，共58頁。平衡鹽液

HanksD-HanksEarlePBSHBSS

back第二十頁，共58頁。第二十頁，共58頁。消化液胰蛋白酶(0.125-0.25%)膠原酶()EDTA(0.01-0.02%)

back第二十一頁，共58頁。第二十一頁，共58頁。抗生素液鏈霉素(100ug/ml)青霉素(100單位/ml)制霉菌素(100單位/ml)終濃度不超過萬分之一為宜

back第二十二頁，共58頁。第二十二頁，共58頁。pH調整液5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOH

back第二十三頁，共58頁。第二十三頁，共58頁。無菌操作洗手著裝近火焰操作試劑瓶等斜放第二十四頁，共58頁。第二十四頁，共58頁。實驗前準備清洗：玻璃、塑料、橡膠、金屬類等消毒：無菌室、培養用液、培養器皿（玻璃、塑料、橡膠、金屬）等

第二十五頁，共58頁。第二十五頁，共58頁。清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

back第二十六頁，共58頁。第二十六頁，共58頁。消毒方法物理消毒法：射線、紫外線、干熱、濕熱、過濾、煮沸等 化學消毒法：乳酸、甲醛、過氧乙酸、新潔爾滅、乙醇等抗生素滅菌第二十七頁，共58頁。第二十七頁，共58頁。二、細胞培養的基本內容

細胞傳代培養*細胞凍存與復蘇*第二十八頁，共58頁。第二十八頁，共58頁。第二十九頁，共58頁。第二十九頁，共58頁。

第三十頁，共58頁。第三十頁，共58頁。細胞計數血細胞計數器：手工計數細胞Coulter計數儀：自動計數計算：以活細胞計數；成團細胞算一個細胞數＝4大格細胞數/4×104個/ml壓線細胞計數原則：

數上不數下，數左不數右第三十一頁，共58頁。第三十一頁，共58頁。第三十二頁，共58頁。第三十二頁，共58頁。第三十三頁，共58頁。第三十三頁，共58頁。常規觀察培養液：顏色：含有指示劑酚紅，顏色反應PH值新鮮的正常：PH7.2～7.4，桃紅色；培養后，細胞產酸，變黃，需換液；透明度：清亮透明，混濁多為污染（懸浮細胞除外）第三十四頁，共58頁。第三十四頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。培養液短期內變黃：1、是否有細菌污染；2、可能培養皿沒清洗干凈，有殘留物；3、細胞生長太快；4、細胞接種量過大。第三十六頁，共58頁。第三十六頁，共58頁。細胞的生長狀態貼壁細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異，最常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯。細胞在生長期常有1-2個核仁，在細胞機能狀態不良時，細胞輪廓會增強，反差增大。若胞質中時而出現顆粒、脫滴和腔泡等，表明細胞代謝不良。

第三十七頁，共58頁。第三十七頁，共58頁。第三十八頁，共58頁。第三十八頁，共58頁。第三十九頁，共58頁。第三十九頁，共58頁。第四十頁，共58頁。第四十頁，共58頁。第四十一頁，共58頁。第四十一頁，共58頁。第四十二頁，共58頁。第四十二頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。第四十五頁，共58頁。第四十五頁，共58頁。懸浮細胞圓形，可以單個細胞或聚集成團生長；細胞透亮，核、膜分界清楚；可大量繁殖，鏡下可見分裂期細胞；肉眼可見在培養瓶中可沉底，輕輕晃動后均勻分布；培養基清亮。培養生長不好時，聚集成團的細胞少，生長慢，細胞有皺縮、破碎、透光性降低等現象。第四十六頁，共58頁。第四十六頁，共58頁。第四十七頁，共58頁。第四十七頁，共58頁。第四十八頁，共58頁。第四十八頁，共58頁。微生物污染傳代或換液后24h～48h可觀察到；細菌、真菌污染的典型表現：培養液混濁，液體內漂浮有菌絲或細菌；支原體污染：不明顯，細胞生長明顯變緩，胞質內顆粒增多，有中毒表現，但培養液多不發生混濁。第四十九頁，共58頁。第四十九頁，共58頁。第五十頁，共58頁。第五十頁，共58頁。第五十一頁，共58頁。第五十一頁，共58頁。第五十二頁，共58頁。第五十二頁，共58頁。

細胞凍存與復蘇細胞凍存（緩慢）細胞復蘇（快速）凍存和復蘇的原則：慢凍快融第五十三頁，共58頁。第五十三頁，共58頁。細胞凍存和復蘇優點：細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。第五十四頁，共58頁。第五十四頁，共58頁。細胞凍存方法配制凍存液：20%血清培養基＋10%DMSODMSO溶解要產熱，應提前配，避免傷細胞。

DMSO的作用收集對數生長期細胞，加入適量凍存液,用吸管吹打成細胞懸液（1×106～5×106細胞/ml)加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍批號。第五十五頁，共58頁。第五十五頁，共58頁。慢凍程序原則：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min；當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min；當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。GMP程序：將冷凍管（管口朝上）放入紗布袋內，4°冰箱0.5h；－20°冰箱0.5h；－70°冰箱0.5h；轉入液氮。簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第五十六頁，共58頁。第五十六頁，共58頁。細胞復蘇方法

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