麻疹病毒的感染性克隆研究,病毒學論文麻疹病毒屬從屬于副黏病毒科副黏病毒亞科，共6個病毒成員，包括犬瘟熱病毒〔Caninedistem-pervirus,CDV〕、麻疹病毒〔Morbillivirus〕、海豹瘟病毒〔Phocinedistempervirus,PDV〕、牛瘟病毒〔Rinderpestvirus,RPV〕、鯨類動物麻疹病毒〔Ceta-ceanmorbillivirus,CeMV〕和小反芻獸疫病毒〔Pes-te-des-petits-ruminantsvirus,PPRV〕，核酸序列為不分節段單股負鏈RNA,基因長度為16kb左右，基因組含有6個基因，從3端到5端依次為N-P-M-F-H-L,依次編碼核衣殼蛋白〔nucleocapsidprotein,N〕、磷蛋白〔phosphoprotein,P〕、基質膜蛋白〔ma-trixprotein,M〕、融合蛋白〔fusionprotein,F〕、血凝蛋白〔hemagglutinin,H〕和大蛋白〔largevirus-spec-ifiedRNApolymeraseprotein,L〕，以及非構造蛋白V和C.麻疹病毒對人和動物危害極大，當前牛瘟病毒已被成功凈化，其他病毒的凈化工作還有待進一步加強，解決這一難題均可通過構建麻疹病毒屬病毒全長感染性克隆來實現。1反向遺傳操作系統文獻資料顯示，當前應用于不分節段負鏈RNA病毒的反向遺傳系統主要有T7RNA聚合酶和RNA聚合酶Ⅱ反向遺傳操作系統[1].1.1基于T7RNA聚合酶的反向遺傳操作系統T7RNA聚合酶〔T7RNApolymerase〕是一種由T7噬菌體編碼RNA聚合酶，長度為883個氨基酸，分子質量約99ku,專門催化53方向的RNA合成經過。啟動子T7RNA聚合酶專一性強，即只會轉錄T7啟動子下游的DNA.轉錄一旦開場，聚合酶就會沿著模板方向不斷向前移動合成RNA,直至碰到終止子〔terminator〕序列為止，不再向新合成的RNA鏈繼續添加核苷酸，進而新合成的RNA鏈便從DNA模板解離[2].基于T7RNA酶其轉錄具有嚴格的合成高效性和轉錄特異性的優點，廣泛應用于麻疹病毒屬病毒的全長cDNA轉錄載體的構建[3].T7RNA聚合酶細胞系的應用極大地提高了病毒的拯救效率，借助此細胞系轉染含病毒基因組cDNA克隆和輔助表示出質粒就能夠實現病毒的拯救[4].將含有T7RNA聚合酶的真核質粒轉染BHK-21細胞，通過使用新霉素加壓挑選，獲得一株穩定表示出T7RNA聚合酶的細胞BSRT7/5,該細胞系已被廣泛應用[5].也有學者將T7RNA聚合酶表示出在豬腎細胞，完成了豬瘟病毒的拯救。1.2基于RNA聚合酶Ⅱ的反向遺傳操作系統T7RNA聚合酶系統需要預先感染攜帶T7RNA聚合酶的重組痘病毒或轉染能表示出T7RNA聚合酶的特定細胞系，操作經過相對繁瑣，且易造成外源病毒污染。為解決上述難題，國內外學者不斷嘗試建立一種僅借助于細胞內RNA聚合酶的拯救系統。RNA聚合酶Ⅱ位于細胞核的核質內，蛋白分子質量為550ku,由12個亞基組成，負責合成mR-NA的前體。當前已成為應用較多的轉錄系統之一，商品化的真核轉錄載體的構建多該轉錄系統。最常見的RNA聚合酶Ⅱ啟動子為猿病毒40啟動子和人的巨細胞病毒啟動子。RNA聚合酶Ⅱ的轉錄產物于3末端被切斷，經腺苷酸化后合成RNA,無明顯的RNA轉錄終止信號[6].諸多學者用含人、犬、棉鼠和羊等SLAM受體的真核質粒轉染sf9、CHO、Vero、MDCK、CRFK、BHK-21和CV1等細胞，通過加壓挑選，獲得穩定表示出SLAM的細胞系，該細胞系在分離病毒和反向遺傳等領域被廣泛應用[7-8].2牛瘟病毒的感染性克隆牛瘟雖已被消滅，但牛瘟病毒感染性克隆的研究在很大程度上推動了其他病毒的相關研究，為其他病毒的凈化創造條件。BaronMD等[9]克隆出具有精到準確末端的牛瘟病毒的全基因組序列，并通過可表示出T7RNA聚合酶的重組痘病毒，成功拯救RBOK疫苗株。DasSC等[10]通過制備嵌合的RPV〔即PPRV的H或F基因取代RPVH或F基因〕，結果表示清楚，當僅取代1個基因無法成功拯救病毒，同時取代2個基因，才能夠成功拯救嵌合病毒，講明F和H基因同時存在方可成功拯救牛瘟病毒。ParidaS等[11]成功拯救出一種嵌合牛瘟病毒系統，結果顯示，該嵌合體病毒在細胞培養維持高效率的復制，使用該嵌合疫苗接種的牛無不良反響。Ban-yardAC等[12]于2018年成功拯救在RPV全基因組的P基因下游和M基因上游之間具有獨立轉錄單元的EGFP基因的RPV,使用共聚焦顯微鏡即可完成RPV復制的檢測。3犬瘟熱病毒的感染性克隆當前已成功構建Onderstepoort、A75/17、5804P、OS和neurovirulentSnyderHill等病毒株的感染性克隆[13].GassenU等[14]利用T7RNA聚合酶系統成功拯救CDVOnderstepoort疫苗株，采用點突變技術于L基因的編碼區突變2個堿基，實現拯救病毒和親本病毒的區分。PlattetP等[15]也構建出CDVA75/17株的感染性克隆，并將GFP成功插入CDV基因組，拯救出能夠表示出GFP的重組病毒。vonMesslingV等[16]在研究中對重組病毒的細胞嗜性、融合特性和生長特性與親本毒株比擬后發現，影響CDV細胞嗜性和細胞致病性的主要決定因子不是病毒骨架。也有學者以馴化致弱后的犬瘟熱病毒小熊貓株作為模板，成功拯救出CDV小熊貓株。近年來，國內外學者開展了大量CDV致病機理領域的研究工作，LudlowM等[17]在構建CDVSH株感染性克隆的基礎上，采用反向遺傳學技術將EGFP或者紅色熒光蛋白插入到CDV基因組中，用拯救的病毒感染雪貂，通過檢測報告基因的表示出，表示清楚CDV感染動物以后能迅速突破血腦屏障進入腦脊液，并擴散到蛛網膜下腔，引起動物發生急性病毒性腦膜炎，進一步促進了患病動物體內病毒的傳播途徑的敏感性病理評估，成功構建出研究CDV傳播機理和急性病毒性腦膜炎發病機理的新型模型。也有研究將序列比對，在CDV基因組M和F基因之間存在的非翻譯區〔UTR〕具有較高的變異性，利用反向遺傳技術將CDV不同毒株之間的M~F區段進行互相交換，發現這種改變并不影響病毒的毒力或者表型，證明該區段在功能上能夠互換。RouxelRN等[18]將CDV的M、F、H與MV的反向遺傳載體構建嵌合疫苗，由此產生的病毒沒有引起雪貂疾病或免疫抑制，并具有一定的免疫保衛作用。4小反芻獸疫病毒的感染性克隆小反芻獸疫病毒主要感染小反芻動物，表現為發熱、口炎、腹瀉和肺炎，在世界范圍內廣泛流行。國外學者成功克隆PPRV的全基因序列，利用精到準確的3和5末端構建出的Tu/00株PPRV的微型基因組，并針對感染性克隆的啟動子開展研究，結果表示清楚，有效的微型基因組須包括順式元件、反基因組的啟動子和3個輔助性質粒〔即N、P和L〕。將全長分4段進行擴增，將基因內部酶切位點進行連接，并將報告基因eGFP插入P基因與M基因之間[19].國內有學者將外源表位與N蛋白的羧基端融合，替代原始的N蛋白的輔助質粒，結果證明外源表位幾乎不影響病毒的拯救，表示清楚融合外源表位后對N蛋白的功能影響較小[20].在這里基礎之上，YinC等[21]利用已構建的PPRV/N75/1株反向遺傳操作系統，構建了表示出亞洲1型FMDV-VP1蛋白的重組病毒，接種山羊和牛均可誘導產生PPRV和FMDV中和抗體，結果表示清楚，針對亞洲1型FMDV強毒的攻擊的具有免疫保衛作用，講明PPRV/N75/1株作為活載體疫苗具備技術可行性。YunusM等[22]從病毒感染細胞中提取和純化的核糖核蛋白復合物、N蛋白包裹的RNA模板和在昆蟲細胞中表示出的重組聚合酶復合物，并將這些成分組合在一起建立PPRV的體外轉錄系統，該系統可在體外持續轉錄所有蛋白的mRNA,表現出梯度轉錄特性。Mu-nirajuM等[23]利用體外轉錄的方式方法成功拯救Mo-rocco/2008.WangZ等[24]于西藏山羊體內初次檢測并分離得到病毒，利用體外轉錄系統成功拯救了PPRVTibet/Bharal/2008株。5結束語反向遺傳學已經廣泛應用于生命科學研究的各個領域，對于病毒而言，借助分子生物學和基因工程技術，研究范圍不斷地拓展和延伸。麻疹病毒屬成員的致病機理的研究相對復雜，反向遺傳操作技術成為其致病機理研究的輔助