緒論酶分離純化演示文稿當前1頁，總共56頁。（優選）緒論酶分離純化當前2頁，總共56頁。酶的提取與分離純化將酶從細胞或發酵液中取出，再與雜質分開，獲得所需的酶產品。酶的分離純化工作,是酶學研究的基礎.酶的純化過程就目前而言,還是門實驗科學.當前3頁，總共56頁。酶的純化過程與一般蛋白純化過程相比有本身獨有的特點:一是特定的一種酶在細胞中含量很少;二是酶可通過測定活力的方法加以跟蹤.1、建立一個可靠和快速的測活方法；2、酶原料的選擇；3、酶的提取；4、酶的提純；5、酶的純度檢驗。酶分離純化的一般原則:當前4頁，總共56頁。一細胞破碎（link)二酶的提取(link)三離心分離(link)四過濾與膜分離(link)

五沉淀分離(link)六層析分離七電泳分離八萃取分離九酶的結晶十濃縮與干燥主要內容go當前5頁，總共56頁。一細胞破碎大多數酶存在于細胞內，需破碎后才能提純細胞不同，結構不同，所用的破碎方法和條件有所不同細胞的破碎方法：（一）機械破碎法link（二）物理破碎法link（三）化學破碎法link（四）酶學破碎法link

back當前6頁，總共56頁。原理：機械運動所產生的剪力作用于細胞1機械搗碎法：搗碎機，10000rpm，實驗、生產規模均可2研磨法：研缽、石磨、球磨、細菌磨等研磨器械，效率較低3勻漿法：勻漿器，用于顆粒細小的組織細胞破碎程度高。對酶破碎少，難于工業化。Back（一）機械破碎法當前7頁，總共56頁。包括:1、溫度差破碎法;2、壓力差破碎法;3、超聲波破碎法;（二）物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細胞破碎當前8頁，總共56頁。1、溫度差破碎法冷凍高溫，用于脆弱易破菌，難以工業化;于冷藏庫或干冰反復于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結變性。

或:將材料投入沸水中，于90℃左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。

當前9頁，總共56頁。2、壓力差破碎法高壓沖擊法用活塞或沖擊錘加高壓沖擊菌體細胞和冰晶石英沙等混合物。突然降壓法加壓至30MP以上，打開出口閥突然降為常壓爆破性減壓法用氮氣或二氧化碳充壓至幾十至幾百大氣壓。滲透壓差法利用滲透壓的變化而使細胞破碎，常用于從海洋微生物中提取某些酶。當前10頁，總共56頁。頻率10~20KHz，功率100~150W，溫度0~10oC，pH4~7，時間3~10min，間隔多次;對數生長期細胞，細胞濃度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz聲波或10～500kHz超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便.且效果也好，但一次處理量較小;應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在;處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。3、超聲波破碎法在超聲波的作用下，細胞膜由于空穴作用而破碎。破壞程度與輸出功率、破碎時間密切相關，與頻率關系不大。操作條件Back當前11頁，總共56頁。（三）化學破碎法應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結構改變或破壞。有機溶劑（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經提取可使膜結合酶或胞內酶等釋出胞外。

1、有機溶液處理粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性。操作當前12頁，總共56頁。表面活性劑和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞膜結構破壞，增加膜的透過性。離子型表面活性劑會使酶的結構破壞，不用之。常用的非離子型表面活性劑為：Triton和Tween。用凝膠層析等方法除去表面活性劑，以便酶的進一步純化。對膜結合酶的提取特別有效。2、表面活性劑處理Back當前13頁，總共56頁。（四）酶學破碎法在一定條件下，通過外加的酶或細胞本身存在的酶的作用，使細胞破碎。簡單原理:用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1、外加酶處理當前14頁，總共56頁。1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。革蘭氏陽性菌：細胞結構和形狀依賴于壁上的肽多糖，溶菌酶能專一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷鍵。革蘭氏陰性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其細胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶；霉菌：其細胞壁含有幾丁質，可用幾丁質酶；植物細胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。當前15頁，總共56頁。將待破碎的鮮材料在一定pH和適當的溫度下，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化，隨時要調節pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。適宜的自溶條件：溫度、pH值、離子強度等加入噬菌體感染細胞電離輻謝2、自溶法Back當前16頁，總共56頁。二酶的提取是指在一定條件下，用適當的溶劑處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑中的過程。也稱酶的抽提。大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，也是提取蛋白質的最常用溶劑。

當前17頁，總共56頁。鹽溶現象:在一定濃度的鹽存在下,酶的溶解度增加.鹽析現象:當鹽的濃度太高,蛋白的濃度反而下降,從溶液中析出.一般采用稀鹽溶液，0.02~0.05mol/L。

等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L氯化鈉溶液應用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。酶提取的主要方法1、鹽溶液提取當前18頁，總共56頁。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合，也常使用焦磷酸鈉緩沖液等。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質需用1mol/L以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶，細胞破碎后選擇適當的鹽濃度及pH，一般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊的，需采用有機溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。當前19頁，總共56頁。蛋白質提取液的pH值首先應保證在蛋白質穩定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。酸性條件下溶解度較大，且穩定性較好，宜用酸溶液提取。

2、酸溶液提取、堿溶液提取原則：當前20頁，總共56頁。如細胞色素C屬堿性蛋白質，常用稀酸提取；肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提取；某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式存在，選擇pH3～6范圍對于分離提取是有利的。當前21頁，總共56頁。與脂質結合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶需用有機溶劑提取。有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。例:從一些粒線體（Mitochondria)及微粒體（Microsome)等含多量脂質物質中提取蛋白質時，采用Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解10%，因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可占據蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。3、有機溶劑提取當前22頁，總共56頁。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度-2℃至40℃）。國內用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。用之提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。當前23頁，總共56頁。影響酶提取的主要因素1、溫度為了防止酶變性失活，溫度不宜高；多數酶的提取溫度在5℃以下；耐溫較高的酶可適當提高溫度，以提高酶溶解度和擴散速率。少數對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。當前24頁，總共56頁。2、pH值為了防止酶的變性，pH不宜過高或過低；溶液的pH值應遠離酶的等電點，以增加酶的溶解度。3、提取液的體積提取液的用量增加，可提高提取率；過量，酶濃度降低，不利進一步純化。back當前25頁，總共56頁。三離心分離離心：借助離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、密度的物質分離的技術；要根據欲分離物質及雜質的大小、密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。當前26頁，總共56頁。1、常速離心機最大轉速8000rpm。2、高速（冷凍）離心機1×104-2.5×104rpm3、超速離心機轉速：2.5-8×104rpm，分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機裝有光學檢測系統、自動記錄系統、數據處理系統；離心機的種類與用途當前27頁，總共56頁。臺式高、超速離心機0.6-10萬轉/分以上離心機制備性分析性分析性超速離心機普通離心機冰凍離心機臺式（或地面式）普通離心機大容量冰凍離心機小于0.6萬轉/分高速冰凍離心機0.6-2.5萬超速冰凍離心機2.5-8萬或更高(分析性超速離心主要用于檢測大分子物質的沉降特征和結構等)概述當前28頁，總共56頁。當前29頁，總共56頁。當前30頁，總共56頁。當前31頁，總共56頁。當前32頁，總共56頁。對常速、高速離心,由于所分離的顆粒大小和密度相差較大,較易達到效果,應用以上離心設備;若從樣品液中分離2種以上大不密度不同的顆粒,則應用以下包括差速離心在內的制備性超離心技術;離心方法的選用當前33頁，總共56頁。一般為4oC。穩定性好的酶，可取室溫；超高速離心需冷凍。pH值應處于酶穩定的pH范圍。溫度和pH值back當前34頁，總共56頁。四過濾與膜分離過濾

借助過濾介質將大小不同，形狀不同的物質分離的技術介質有濾紙、纖維、陶瓷、高分子膜等。以膜為過濾介質的過濾稱膜分離技術；微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都屬于膜分離技術當前35頁，總共56頁。表1-2過濾的分類與特性（P16）類別

截留的顆粒大小主要物質過濾介質粗濾>2um酵母、霉菌、動植物細胞、固形物濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷微濾0.2~2um細菌、灰塵微濾膜超濾20A~0.2um病毒、生物大分子超濾膜反滲透<20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜當前36頁，總共56頁。表例：當前37頁，總共56頁。一、非膜過濾截留顆粒直徑大于2μm,用于分離酵母、霉菌、動植物細胞、培養基殘渣等。過濾介質有濾紙、濾布、多孔陶瓷等。(1)常壓過濾以液位差為推動力，易操作，分離效果差，難成規模。(2)加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣為推動力。效果較好，生產上應用廣泛。(3)減壓過濾真空過濾、抽濾。多用于粘性不大的物料。1、粗濾2、微濾微孔過濾,截留顆粒直徑0.2～2μm，光學顯微鏡可見顆粒，采用微孔陶瓷、微濾膜等。當前38頁，總共56頁。二、膜分離技術借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質顆粒或分子分離的技術。薄膜有丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。當前39頁，總共56頁。

膜過程國家年代應用

微濾*德國1920年實驗室用（細菌過濾器）

超濾*德國1930年實驗室用

血液透析*荷蘭1950年人工腎

電滲析#美國1955年脫鹽

反滲透#美國1960年海水脫鹽

超濾#美國1960年大分子物質濃縮

氣體分離#美國1979年氫回收

膜蒸餾*德國1981年水溶液濃縮

全蒸發#德國/荷蘭1982年有機溶液脫水膜分離技術發展階段*:小規模；#：工業規模當前40頁，總共56頁。以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力；根據截留的顆粒大小可分為3種；MEF微濾器根據顆粒或分子通過薄膜的原理和推動力不同分三類。（1）微濾截留的物質顆粒直徑為0.2～2um，操作壓力0.1MPa以下。1、加壓膜分離當前41頁，總共56頁。(2)超濾截留的物質顆粒直徑為20～2000?（0.2um）；可同時截留菌絲體和可溶性蛋白。

操作壓力50～700KPa；特別適于液體酶制劑的生產；對需要輔酶的酶的生產不適用；SHM系列膜分離裝置【截留分子量】：300～50000道爾頓；

【操作壓力】：0.1～0。2Mpa

【操作溫度】：20～50℃。在發酵行業中，由于傳統分離工藝技術條件的限制，預處理中常有5-15%的產品損失，大量的可溶性蛋白、大分子雜質被帶入到下游工序，增加了后提取工藝的環節和負荷，影響產品質量及生產收率。Ultra-flo超濾分離技術徹底突破這一技術瓶頸。當前42頁，總共56頁。超濾(續)超乎尋常的膜通量，且維持恒定適合處理高粘度、高含固量料液濃縮倍數極高，可使濃縮液呈糊狀消除濃差極化，不易堵塞，易清洗系統可逐級拓展，中試結果完全適用于生產規模當前43頁，總共56頁。(3)反滲透反滲透（RO）是膜分離技術的一個重要組成部分

膜孔徑小于20?，操作壓力為0.7～13MPa。用于海水淡化。在水過濾時利用反滲透膜的選擇性透過原理，通過設備的高壓泵對經過反滲透膜的原水施加一定壓力，在壓力作用下原水中的水分子可以透過膜而滲析出來，而其他無機鹽、微生物與有機物等卻由于反滲透膜對這些物質的截留特性而不能透過膜，從而可以獲得純凈的無離子水。

當前44頁，總共56頁。（2）離子交換膜電滲析2、電場膜分離在半透膜的兩側分別裝上正負極，電場作用下小分子帶電物或離子向與其本身電荷相反的電極移動，透過半透膜，達到分離目的。（1）電滲析樣品液緩沖液如圖離子交換膜代替一般膜當前45頁，總共56頁。主要指透析；利用小分子擴散作用透過半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白質、核酸等生物大分子的分離。透析設備簡單，但操作時間長，要更換水或緩沖液。3、擴散膜（透析）膜分離膜公司網站Back當前46頁，總共56頁。五沉淀分離改變某些條件，使溶液中某種溶質溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達到與其它溶質分離。是酶分離純化常用的方法之一。其本質是降低溶液的溶解度。方法有鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復合沉淀等,表4-3.當前47頁，總共56頁。在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質和酶因溶解度各不相同而分離。鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度？鹽在溶液中離解為正負離子，反離子作用改變蛋白酶分子表面的電荷；同時離子存在改變水活度使分子表面水化膜改變。1、鹽析沉淀法『鹽溶』是加鹽使蛋白質融入水中，『鹽析』是加鹽使蛋白質沉淀出來。兩者所加的鹽類不同，其作用