枇杷葉內生菌菌種內細菌的分離培養與鑒定［摘要］目的：對3種不同來源的枇杷葉中內生菌進行培養與鑒定。方法：將枇杷葉削除表皮，研缽研碎后獲得組織提取液，用稀釋法對葉內生菌中的細菌進行培養，最后單染色法對細菌進行染色，用顯微觀察法對細菌進行觀察。結果：培養皿中菌落形態各自呈現出不同特征。結論：枇杷葉內生菌中不同細菌的種群、數量存在顯著差異。［關鍵字］枇杷內生菌多樣性1引言：枇杷：屬薔薇科枇杷屬植物，其花、果、葉和根均可入藥，具有清肺，降氣化痰的功效。果實風味甘酸、性涼，具有清肺、潤肺、寧嗽、止咳、合胃、止渴、下氣、止吐逆、主上焦熱和潤五肺之功效。國內已開發出強力枇杷露等多種枇杷制劑，因枇杷具有多種功效，廣泛應用于臨床用藥。因此，我們對枇杷內生細菌進行了培養、菌株分離等初步研究。2實驗部分：2.1材料新鮮翠綠枇杷葉數片(采自浙江理工大學下沙校區百草園4棵不同枇杷樹上)。原植物經鑒定為枇杷牛肉膏蛋白胨固體培養基(用于培養)、牛肉膏蛋白胨固體培養基+制霉菌素(用于篩選細菌)。2.2操作方法：2.2.1內生細菌的分離：用自來水將新鮮植物表面洗凈，于1000ml95%酒精中浸泡3-5min，后無菌水沖洗3-4次，至于超凈臺備用。用研缽將枇杷葉碾碎，加入適量無菌水，后用1ml移液器吸取原液10ml于空帶蓋試管中，標號①。用稀釋法分別將原液稀釋成10人-1?10人-5倍于已裝有9ml無菌水試管中配成10ml溶液，分別標號②?⑥，獲得梯度樣液，至于超凈臺中備用。在超凈臺中將上述6管樣液用200ul移液器各移取200ul至已倒好的6個平板中，酒精燈旁分別涂布，對應編號，標記稀釋倍數、日期、組別，于26^培養箱中倒置培養3?5天。2.2.2內生細菌的鑒定：對培養皿中分離所得的細菌分別挑取5個菌斑，采用單染色法分別對菌斑染色，后對染色后的細菌進行顯微形態特征的觀察、鑒定。2.3操作過程：2.3.1制樣液在超凈臺上，用研缽將早期置于其中的枇杷葉研碎,用無菌水溶解，紗布過濾，得到樣液備用。用1ml移液器從裝有樣液的燒杯中吸取1mL注入已裝有9mL無菌水的試管中，充分混勻,編號②。后用1ml移液器從②號試管中吸取1mL樣液注入另一裝有9mL無菌水的試管中,編號②。以此類推分別制成10人-3?10人-5倍稀釋度的各種樣液，分別編號③?⑥。2.3.2涂布平板法分離微生物⑴倒平板:將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基冷卻至55-60OC時,向其中加入制霉菌素0.6mL(50ug/mL),倒平板.方法:右手持盛有培養基的錐形瓶，置火焰旁5cm?10cm內，左手用手掌邊緣和小指控制培養皿,錐形瓶口在火焰上滅菌,后左手將培養皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約15mL,加蓋后平置于臺面上,待冷凝后即成平板.(2)涂布:將培養基分別用記號筆寫上1?10人-56種稀釋度，后用200ul移液器分別從10人-1,10人-2,10人-3,10人-4,10人-5的稀釋液中取200uL對號放入已寫好稀釋度的平板中,后再吸取原液0.2ml于編號1倍的培養基中。用無菌玻璃涂布棒在培養基表面輕輕地涂布均勻.⑶培養:將牛肉膏蛋白胨平板于26OC培養箱中倒置培養3~5日.2.3.3觀察:幾天后進行觀察記錄，并將分離所得的細菌用單染色法染色后鏡檢.細菌的單染色法：1、 涂片：取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無菌操作分別挑取培養所得細菌于載玻片的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜(每一種菌制一片)2、 干燥：于室溫中自然干燥。3、 固定：涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細胞質凝固，以固定細菌的形態，并使其不易脫落。4、 染色：水平放置玻片，滴加染色液于涂片薄膜上，番紅染色液染色1—2分鐘。5、 水洗：傾去染液，自來水沖洗。用吸水紙吸取多余水分，自然干燥。2.4 結果觀察：2.4.13天后：5個培養基中，編號10A-1培養基中長有單菌落，菌落呈現出小，黃色,濕潤,圓形，隆起,不透明，邊緣整齊等特點，而其余培養基均無菌生成；1星期后：5個培養基中，編號10八-1培養基中長有單菌落，呈現出大，黃色，濕潤，圓形，隆起,不透明，邊緣整齊等特點，而其余培養基均無菌生成；2星期后：5個培養基中，編號10人-1,10人-2培養基中長有單菌落。10人-1培養基中長有許多單菌落，其中的單菌落呈現出單個分散，小而均勻，個別微大，顏色有黃色和白色，濕潤，部分菌落有隆起,邊緣整齊且不透明等特點；10人-2培養基中長有許多單菌落，其中的菌落呈現出單個分散，小而均勻，顏色為粉色，濕潤，扁平，半透明，邊緣整齊，有個別邊緣不整齊等特點。而其余3個培養基仍沒有菌生成.對染色后細菌鏡檢觀察后，我們發現細菌均呈現出不同特點，細菌種群、數量存在顯著差異。結果觀察與討論:結果觀察:

3天后5個培養基中，除10、倍稀釋度的培養基中長有菌落外，其余培養基均沒有菌生成。10”-1倍稀釋度培養基:只生成一個菌落很小，黃色，濕潤，圓形，隆起，不透明，邊緣整齊。1星期后5個培養基中，除10”-1倍稀釋度的培養基中長有菌落外,其余培養基均沒有菌生成。10”-1倍稀釋度培養基:只生成一個菌落大，黃色，濕潤，圓形，隆起，不透明，邊緣整齊。2星期后5個培養基中，10”-1,10”-2倍稀釋度的培養基中長有菌落，其余3個培養基仍沒有菌生成。

10=倍稀釋度培養基:長有很多菌落單個分散，小而均勻，個別微大，顏色有黃色和白色，濕潤，部分菌落有隆起，邊緣整齊且不透明。10、倍培養基:長有很多菌落單個分散，小而均勻，顏色為粉色，濕潤，扁平，半透明，邊緣整齊,有個別邊緣不整齊。菌落編號辨別要點菌落描述辨別結果濕十表面邊緣隆起形狀顏色水溶性色素透明度厚薄大小松密大小正面反面1薄梢大扁平整齊\粉色淡粉半透細菌2薄梢大扁平整齊\粉色淡粉半透細菌3薄小扁平整齊\粉色淡粉半透細菌4薄大扁平整齊\粉色淡粉半透細菌5薄大扁平整齊\粉色淡粉半透細菌6薄稍小扁平整齊\粉色淡粉半透細菌7薄大扁平整齊\白色黃色半透細菌8厚很大^起整齊圓黃色黃色不透細菌9薄梢大扁平整齊橢圓白色黃色不透細菌10薄（半濕潤）大扁平整齊圓白色黃色不透細菌總結與展望:蒸汽滅菌后應迅速進行倒平板操作，目的是為了防止培養基凝固。涂布分離應在培養基完全凝固后進行，不可過早，否則操作時容易將培養基弄破分裝時培養基液不能超過錐形瓶的1/2，目的是為了防止高溫蒸汽滅菌時溢出本次實驗最終只有稀釋倍數為10人-1的培養基上生長有菌落，分析其原因可能有以下幾點：實驗操作時，枇杷葉在酒精中浸泡時間太長，大部分菌被殺死在配置