第十八章高效液相色譜法HPLC1經典液相色譜法為基礎;引入氣相色譜法的理論和實驗技術;高壓輸送流動相;高效固定相及高靈敏度檢測器;現代液相色譜分析方法。2與經典液相色譜法相比

顆粒極細（一般為10m以下）、規則均勻的固定相，(鍵合相)傳質阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達109g，而熒光檢測器最小檢測限可達1012g。

3與氣相色譜法相比不受試樣的揮發性和熱穩定性的限制，應用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進行分離，不需要高柱溫。4第一節高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）分子排阻色譜法（SEC）化學鍵合相色譜法5二、化學鍵合相色譜法

以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相6優點：固定相的均一性和穩定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長；柱效高；重現性好；能使用的流動相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據化學鍵合相與流動相極性的相對強弱7（一）正相鍵合相色譜法

固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經典：水飽和的硅膠）流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物8正相鍵合相色譜法分離選擇性：極性強的組分k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。分離機制：分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質在兩相的溶解吸附：溶質與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用9（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動相：水為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調整劑常用甲醇－水、乙腈－水等應用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機酸、堿及鹽等）10保留機制疏溶劑理論（solvophobictheory）溶質的保留主要是溶質分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質分子與鍵合相的烴基發生疏水締合。不是溶質分子與鍵合相間的色散力，11保留行為的主要影響因素1、溶質的分子結構（極性）極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。 同系物碳數越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。2、固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質的k越大。123、流動相極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質的k增大pH：影響弱酸、弱減的離解 流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。13離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatography；ISC）用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調節流動相的pH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱堿14把離子對試劑加入到含水流動相中，被分析的組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（或稱對稱離子，counterion）生成不荷電的中性離子對，從而增加溶質與非極性固定相的作用，使分配系數增加，改善分離效果。用于分離可離子化或離子型化合物。（三）反相離子對色譜法

pairedionchromatography；PIC

ionpairchromatography；IPC15離子對模型固定相Bm++Am-?（B+·A-）m?（B+·A-）s流動相通式+(BH+·RSO3-）mB+H+?BH+RSO3Na?RSO3-+Na+離子對(BH+·RSO3-）s16影響保留因子的因素離子對試劑的種類和濃度：在反相離子對色譜中，離子對試劑碳鏈長度增加，溶質的k增大；在一定范圍內試劑的濃度升高，溶質的k增大流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質（同一般RP-HPLC）。17適用范圍：有機酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。分析酸類或帶負電荷物質：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等分析堿類或帶正電荷的物質：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、正庚烷基磺酸鈉（PICB7）。

適用范圍和離子對試劑的選擇18三、其他高效液相色譜法

（一）離子色譜法

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。離子色譜法可分為兩大類：抑制型（雙柱型）和非抑制型（單柱型）以分析陰離子X-為例：分離柱：填有低交換容量的陰離子交換劑抑制柱：填有高交換容量的陽離子交換劑（稱為陰離子抑制柱）。19兩柱上的反應：分離柱：交換反應：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脫反應：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX抑制柱：與組分反應：R--H++NaX→R--Na++HX與洗脫劑反應:R--H++NaOH→R--Na++H2O20(二）手性色譜法手性色譜法是利用手性固定相或手性流動相添加劑分離分析手性化合物的對映異構體的色譜法。間接法分析手性化合物的對映體，即將試樣與適當的手性試劑(單一對映體)反應，使其一對對映異構體轉變為非對映異構體，然后用常規HPLC方法分離分析。21實現手性拆分的基本原理是對映異構體與手性選擇物(固定相或添加劑)形成瞬間非對映立體異構“配合物”，由于兩對映異構體形成的“配合物”的穩定性不同，因而得到分離。手性固定相的種類繁多，它們與對映體的作用力也各有個同。如π-氫鍵型固定相與手性化合物之間一般認為有3種作用力，即π-π相互作用、氫鍵作用和偶極間相互作用，化合物與固定相之間的作用部位至少有一個受對映體立體構型的影響。22

（三）親和色譜法（AC）

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離的一種方法。它通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環氧、聯氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。23第二節高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇固定相應符合下列要求：顆粒細且均勻；傳質快；機械強度高，能耐高壓；化學穩定性好，不與流動相發生化學反應。24一、化學鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類非極性鍵合相：非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長鏈烷基可使溶質的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩定性更好。25弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜極性鍵合相：常用氨基﹑氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)鍵合硅膠一般用于正相色譜特殊用途的鍵合相26（二）鍵合相的性質和特點

鍵合反應硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進行硅烷化反應

如：YWG－C18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅膠Spherisorb上鍵合了ODS。27鍵合相的性質含碳量：含碳的百分數覆蓋度：已反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例封尾（end-capping）：在鍵合反應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。28鍵合相的特點使用過程中不流失；化學穩定性好；適于梯度洗脫；載樣量大注意：流動相的pH一般應在2-8，否則會引起硅膠溶解；不同廠家，不同批號的同一類型鍵合相也可能表現不同的色譜特性。29二、化學鍵合相色譜法的流動相

對流動相的要求：與固定相不發生化學反應。對試樣有適宜的溶解度，使k在1~10范圍內。與檢測器相適應。純度高，粘度小。30（一）流動相對分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定，α主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。增加流動相中強溶劑的比例，其洗脫能力增強，使k變小。31（二）流動相的強度和選擇性溶劑的極性（強度）正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強溶劑的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同混合溶劑（二元或多元流動相）32溶劑極性參數：表示溶劑與乙醇、二氧六環、硝基甲烷相互作用純溶劑的極性參數P′P′=lg（Kg″)e+lg(Kg″)d+lg(Kg″)nKg″極性分配系數P′越大，溶劑的極性越強，在正相色譜中的洗脫能力越強。強度因子反相色譜中的溶劑強度用強度因子S表示。反相色譜中，S大的溶劑洗脫能力強。33混合溶劑的強度溶劑的選擇性Xe、Xd、Xn分別反映溶劑的質子接受能力、質子給予能力和偶極作用力3435三、分離條件的選擇（一）HPLC中的速率理論H=A+B/u+Cu渦流擴散A=2λdp

球形、小粒度、均勻（RSD＜5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A。縱向擴散B=2γDm可以忽略。因為Dl很小，室溫操作，且U大于U最佳，36傳質阻抗固定相傳質阻抗CS可以忽略，因df極小流動相傳質阻抗Cm

要求：dp小，Dm大靜態流動相傳質阻抗：由于部分流動相在固定相微孔內的滯留靜態流動相傳質阻抗系數Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η

要求:固定相dp2、流動相η都小37

H=A+Cmu+Csmu原因：化學鍵合相，液體流動相結果：HPLC的實驗條件應該是：①小粒度、均勻的球形化學鍵合相；②低粘度流動相，流速不宜過快；③柱溫適當。HPLC中的速率理論38（二）正相鍵合相色譜法的分離條件

固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等分離含雙鍵的化合物常用氰基鍵合相，分離多基團化合物常用氨基鍵合相。流動相烷烴加適量極性調節劑39（三）反相鍵合相色譜法的分離條件

固定相非極性鍵合相如ODS流動相以水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調節劑弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑加入0.1%∽1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用40（四）反相離子對色譜法的分離條件

固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的非極性鍵合相，離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反流動相pH使試樣組分與離子對試劑全部離子化有機溶劑及其濃度同一般HPLC41第三節高效液相色譜儀組成輸液系統進樣系統色譜柱系統檢測系統數據記錄處理系統4243一、輸液系統（1）高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復泵雙泵：為了克服流量的脈動。有串聯式和并聯式44來自流動相454647輸液泵應具備的性能：流量精度高且穩定流量范圍寬能在高壓下連續工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕輸液泵操作注意事項：防止固體微粒進入泵體流動相不應含有腐蝕性物質防止溶劑瓶內的流動相被用完不超過規定的最高壓力流動相一般應該先脫氣48（2）梯度洗脫裝置在進行多成分的復雜樣品的分離時，經常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內全部洗脫并達到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術。

液相色譜中通常所說的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。49

線性梯度：在某一段時間內連續而均勻增加流動相強度。

階梯梯度：直接從某一低強度的流動相改變為另一較高強度的流動相。梯度洗脫時，流動相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。50

高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個高壓泵分別按設定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態下進行混合的。51

低壓梯度：只需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統相比，就是在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。52二、分離和進樣系統

進樣器進樣閥（六通閥）、自動進樣裝置色譜柱（column）由柱管和固定相組成分析柱、制備柱性能評價H、n、fs、k和α的重復性，或R。

53

色譜填料：經過制備處理后，用于填充色譜柱的物質顆粒，通常是5-10μm粒徑的球形顆粒。

色譜柱管：內部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內徑4.6mm，長250mm。

色譜柱：也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構成的。5455三、檢測系統

檢測器：用來連續監測經色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。檢測器利用溶質的某一物理或化學性質與流動相有差異的原理，當溶質從色譜柱流出時，會導致流動相背景值發生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來。56（一）檢測器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）57（二）紫外檢測器(ultravioletdetector)

檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。局限：專屬型、濃度型檢測器只能檢測有紫外吸收的物質，流動相的截止波長應小于檢測波長。58固定波長檢測器：254nm可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統和紫外分光光度計相似光電二極管陣列檢測器(photodiodearraydetector；PDAD)：一系列光電二極管，一個二極管對應接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光59光電二極管陣列檢測器工作原理：復光通過流通池，再進入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。606162（三）熒光檢測器(fluorescencedetector；FD)檢測原理：熒光強度(F)與激發光強度(I0)及熒光物質濃度(C)之間的關系為：F=2.3QKI0εCl

Q為量子產率，K為熒光效率，ε為摩爾吸光系數，l為光徑長度。F=KC

特點：選擇性好，專屬型檢測器靈敏度比紫外檢測器高（檢測限10-10g/ml）激發波長(ex)和發射波長(em)的選擇6364（四）安培檢測器安培檢測器安培檢測器的靈敏度很高，尤其適用于痕量組分的分析，凡具有氧化還原活性的物質都能進行檢測，本身沒有氧化還原活性的化合物經衍生化后，也能進行檢測。安培檢測器的工作原理：在電極間施加一恒定電位，當電活性組分經過電極表面時，發生氧化還原反應，產生電量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。反應的電流：65（五）蒸發光散射檢測器

適用于揮發性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、三酰甘油及甾體。66第四節高效液相色譜分析方法

一、定性分析方法1．色譜鑒定法利用色譜定性參數保留時間(或保留體積)和相對保留值或用已知物對照法對組分進行鑒別分析，其原理是同一物質在相同色譜條件下保留時間相同。此法只能對范圍已知的化合物進行定性。6