人血管生長素的真核表達及亞細胞定位張宏斌,武婕,楊太成,冼江,賴晃文,楊傳紅,鄭文嶺【關鍵詞】人血管天生素;,真核表達;,定位;,細胞核[摘要]目的:創立人血管天生素〔angigenin,ANG〕的真核表達體系并在細胞內亞定位。要領:接納亞克隆技能構建重組熒光真核細胞表達質粒pEGFP/ANG,然后經脂質體介導轉染人臍靜脈內皮細胞〔HUVE〕并對轉染細胞內pEGFP/ANG的表達用熒光顯微鏡和免疫組化染色舉行斷定。用共聚焦顯微鏡和免疫電鏡不雅察ANG的亞細胞定位。效果:熒光顯微鏡不雅察可見轉染的HUVE內發出強綠色熒光。免疫組化染色檢測表現,轉染的HUVE中有棕色顆粒。共聚焦顯微鏡及免疫電鏡查抄表現,ANG集聚于細胞核區。結論:以構建的重組體pEGFP/ANG轉染HUVE后,可表達人ANG卵白;表達的ANG定位于細胞核區。[關鍵詞]人血管天生素;真核表達;定位;細胞核血管天生素〔angigenin,ANG〕是一種相對分子質量(r)為14100、pI為9.5、由123個氨基酸構成的卵白質,存在于正凡人的血漿及實體腫瘤構造中,屬于核糖核酸酶超家屬成員[1],其基因定位于14號染色體的q11區。ANG具有很強的促進血管天生的作用。大量研究表白,ANG與腫瘤的快速生長和轉移有嚴密的干系[2,3],肺癌、胰腺癌及乳腺癌等患者的外周血中ANG的程度顯著升高,并且血清ANG的程度與這些腫瘤的生長及轉移呈明顯的正相干,因此,通過檢測血清ANG的程度可猜測腫瘤的產生與生長環境[4-6]。然而,ANG對付創傷、燒傷及血循環較差的股骨頭、半月板等損傷的修復那么具有較大的臨床應用代價。為此,我們構建了人ANG基因的真核表達質粒,并轉染人臍靜脈內皮細胞〔HUVE〕舉行表達,斷定了其亞細胞定位。1質料和要領1.1質料熒光標識表記標幟試劑盒為leularPrbes公司產物。鼠抗Glgi58K或alnexin單克隆抗體〔Ab〕為Siga公司產物。ERⅠ、BaHⅠ為Prega公司產物。熒光質粒pEGFP/2購自lnteh公司。T4DAN毗連酶為寶生物工程〔大連〕產物。Lipfetaine2000為Invitrgen公司產物。DE造就液為Gib公司產物。金標識表記標幟的羊抗鼠IgG抗體為美國ZYED公司產物。質粒抽提試劑盒為上海博彩生物科技產物。抗人ANGAb由本室制備[7]。臍靜脈內皮細胞〔HUVE〕為本室保存。其他生化試劑購自華美生物工程公司等。1.2要領2效果2.1人ANG的真核表達[8]在熒光顯微鏡下,可見pEGFP/ANG質粒轉染的HUVE出現綠色熒光,而未轉染的細胞那么不表現熒光(圖1)。轉染72h后,用SP法免疫組化染色檢測ANG基因的表達表現,重組質粒pEGFP/ANG轉染的HUVE胞質中布滿了棕色顆粒;而空質粒轉染的細胞中,細胞全部呈藍色〔圖2〕。2.2ANG在HUVE中的定位〔1〕共聚焦顯微鏡不雅察:在共聚焦顯微鏡下,可見ANGGFP交融卵白與HUVE的細胞核區相重疊,與高爾基體及內質網無重疊〔圖3〕;而單獨的GFP卵白是漫衍于整個細胞的。〔2〕透射電鏡不雅察:透射電子顯微鏡下不雅察,可見HUVE核的核仁區有濃集的金顆粒,在細胞核區的其他部位也有少數散在的金顆粒;而在細胞質及其他細胞器部位均未見金顆粒〔圖4〕。圖1ANG在HUVE中表達的熒光顯微鏡不雅察〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG轉染的HUVE;B:未轉染的HUVE.圖2ANG在HUVE中表達的免疫組化〔SP法〕染色檢測〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG轉染的HUVE;B:空質粒轉染的HUVE.圖3表達的ANG在HUVE中定位的共聚焦顯微鏡不雅察〔×1000〕〔略〕圖4表達的ANG在HUVE中定位的透射電鏡不雅察〔×60000〕〔略〕3討論ANG通過與血管內皮細胞外貌的受體結合,可激活胞內的第二信使,誘導細胞進入及構造中新生的管狀布局形成〔即新生的血管分支〕等[9,10],從而實現其促進血管生長的作用。血管的形成是構造修復與生長必不成少的緊張環節,因此,ANG的促血管生長作用對構造工程學的生長具有龐大的鞭策作用。已有報道[10],ANG可改進微循環,在血循環較差的半月板纖維軟骨的修復,以及在堵塞或損傷的構造中重修側枝循環等歷程中,也發揮著緊張的作用。本研究中,我們以重組質粒pEGFP/ANG轉染HUVE后,不雅察了ANG的瞬時表達。由于所用真核表達載體中帶有陳訴基因EGFP,因此,在熒光顯微鏡不雅察下,經重組質粒轉染的HUVE中可不雅察到綠色熒光,而未經轉染的細胞那么不表現熒光。同時,我們用免疫組化〔SP法〕染色檢測表白,pEGFP/ANG重組質粒可以或許在HUVE中表達,為進一步開展ANG基因轉移在構造工程學中的應用奠基了必然的基矗透射免疫電鏡及共聚焦顯微鏡不雅察表現,ANG在HUVE中定位于細胞核區,為通過阻斷ANG治療腫瘤的研究提供了必然的實行根據。參考文獻:[1]StrydDJ,FettJ,LbbRR,etal.Ainaidsequenefhuanturderivedangigenin[J].Biheistry,1985,24(20):5486-5494.[2]ShiyaaS,YaasakiK,Kaahara,etal.Inreasedseruangigeninnentratininlretalanerisrrelatedithanerprgressin[J].linanerRes,1999,5(5):1125-1130.[3]iyakeH,HaraI,YaanakaK,etal.Inreasedangigeninexpressinintheturtissueandserufurthelialarinapatientsisrelatedtdiseaseprgressinandreurrene[J].aner,1999,86(2):316-324.[4]張宏斌,郭文軍,吳錦銀,等.腫瘤患者血清血管生長素程度變革的開端研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18〔2〕:190-191.[5]HisaiH,KatJ,Kbune,etal.Inreasedexpressinfangigenininhepatellulararinainrrelatinithturvasularity[J].linanerRes,2022,9(13):4852-4859.[6]ShiyaaS,Kainishi.Angigenininseraasanindependentprgnstifatringastrianer[J].JanerReslinnl,2022,129(4):239-244.[7]張宏斌,江悅華,王捷,等.重組人血管生長素及其單克隆抗體的特性斷定[J].細胞與分子免疫學雜志,2001,17(3):277-279.[8]張宏斌,王捷,武婕,等.重組載體pEGFPANG的構建及ANG基因在HUVE中的表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2022,20〔1〕:15-17.[9]FlkanJ.Therlefangigenesisinturgrth[J].Se