醫學細胞與分子生物學醫學遺傳系

曹軒曹軒，基礎醫學院2號樓1201室Email:2000年于湖南師范大學生命科學學院生物科學專業獲學士學位2008年于武漢大學生科院生化與分子生物學專業獲博士學位2008-2013年在加拿大WesternUniversity醫學院生化系博士后2013-2015年在WesternUniversity醫學院生化系擔任副研究員2015.3-在華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院擔任教授、博導主要研究領域

致力于研究蛋白相互作用的分子機理，探究蛋白功能和作用異常對細胞行為和疾病的影響，應用細胞生物學、分子生物學及生物化學等現代生物學技術，研究重要的癌癥相關蛋白通過RhoGTPases相關的細胞信號通路調控細胞骨架組裝的分子機理，揭示細胞極化、癌細胞EMT轉變、細胞運動以及癌細胞轉移和擴散的分子機制，發展癌癥分子診斷和防治新技術。細胞內動力系統

線粒體（mitochondrion）

除哺乳動物成熟紅細胞外，所有真核細胞都有線粒體，細胞生命活動所需能量的95%來自線粒體，因此線粒體被稱為細胞生命活動的“供能中心”、“動力工廠”和“能量轉換器”。本章教學內容一、線粒體的形態與結構二、線粒體的功能三、線粒體的半自主性與起源四、線粒體病1、線粒體的形態、大小、數量與分布形態光鏡下呈短線狀或顆粒狀。因細胞形態不同而異。大小數量分布差異較大，一般短徑為0.5-1.0um左右，長徑為1.5-3.0um。最大可達10um，稱為巨大線粒體。少則幾十個，多則可達數千，生理活動旺盛細胞中數目多。(mitochondrion:mitochondria)一、線粒體的形態與結構2、線粒體的超微結構◆外膜(outermembrane）：含孔蛋白(porin)，通透性較高◆內膜（innermembrane）：高度不通透性，向內折疊形成嵴（cristae）◆膜間腔（intermembranespace）：含許多可溶性酶、底物及輔助因子◆基質（matrix）：含三羧酸循環酶系、線粒體基因表達酶系以及線粒體DNA、RNA、核糖體等◆基粒(elementaryparticle)：“ATP合酶復合體”

（ATPsynthasecomplex）“F0F1ATP合酶復合體”

（F0-F1ATPsynthasecomplex)在線粒體內膜基質面上垂直附著的柄球狀小體。功能：催化ADP＋PiATPThethree-dimensionalstructureoftheF1ATPase,determinedbyx-raycrystallography(X光結晶學).“ATP合酶復合體”（ATPsynthasecomplex）頭部：偶聯因子1（couplingfactor1,F1），由5種類型、9個亞基組成，組分為α3β3γεδ。其中α和β亞基具有核苷酸結合位點，但只有β亞基的結合位點具有催化ATP合成的活性。F1的功能是催化ATP合成。γ與ε亞基具有很強的親和力，結合形成“轉子”(rotor)，旋轉于α3β3的中央，調節3個β亞基催化位點的開放和關閉。基部：偶聯因子0（F0），由a、b、c這3種亞基按照ab2c10-12的比例組成跨膜的質子通道。F0在ATP合成酶中的作用是將跨膜質子驅動力轉換成扭力矩，驅動“轉子”旋轉。a亞基、b亞基和F1

的δ亞基共同組成“定子”（stator），也稱外周柄。細胞質中合成的蛋白質進入線粒體的通道◆內外膜轉位接觸點（

translocationcontactsite）：線粒體的酶的定位線粒體主要功能:為細胞氧化（cellularoxidation）作用提供場所

，合成ATP，為細胞生命活動提供直接能量。二、線粒體的功能

◆細胞氧化:細胞內氨基酸、脂肪酸、單糖等供能物質在一系列酶的作用下，消耗O2，產生CO2和水，放出能量的過程。此過程中細胞要攝取O2，排出CO2，故又稱為細胞呼吸（cellularrespiration）。酶◆細胞氧化分為四個主要的步驟：糖酵解、乙酰輔酶A的形成、三羧酸循環、電子傳遞偶聯的氧化磷酸化。其中糖酵解在細胞質中進行，而后三步均在線粒體中進行，因此線粒體是細胞氧化的主要基地。1234高能電子從NADH或FADH2經電子傳遞鏈（electrontransferchain）或呼吸鏈（respiratorychain）傳遞給氧形成水，同時伴隨ADP磷酸化形成ATP，這一過程稱為氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）。電子傳遞偶聯的氧化磷酸化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+＋２H(2e+2H+)＝NADH+H+黃素腺嘌呤二核苷酸FAD＋2Ｈ＝FADH2氧化磷酸化的偶聯機制：化學滲透假說（chemiosmotichypothesis）

電子傳遞鏈各組分在線粒體內膜中不對稱分布，當高能電子沿其傳遞時，所釋放的能量將H+從基質泵到膜間隙，形成H+電化學梯度(electrochemicalgradient)。在這個梯度驅使下，H+穿過ATP合成酶回到基質，同時合成ATP，電化學梯度中蘊藏的能量儲存到ATP高能磷酸鍵中。Mitchell，1961基質膜間腔基質氧化磷酸化耦聯與化學滲透假說PeterD.MitchellTheNobelPrizeinChemistry1978wasawardedtoPeterMitchell"forhiscontributiontotheunderstandingofbiologicalenergytransferthroughtheformulationofthechemiosmotictheory"化學滲透假說有兩個特點：強調線粒體膜結構的完整性如果膜不完整，H+

便能自由通過膜，則無法在內膜兩側形成質子動力勢，那么氧化磷酸化就會解偶聯。一些解偶聯劑的作用就在于改變膜對H+的通透性，從而使電子傳遞所釋放的能量不能轉換合成ATP。B.定向化學反應ATP合成反應時，在電化學質子梯度推動下，H+

由膜間隙通過內膜上的ATP合成酶進入基質，其能量促使ADP和Pi合成ATP。BindingChangeMechanism

（Boyer,1979）當H+流順濃度梯度跨膜轉運回流時，驅動基部F0因子和與之相連接的“轉子”（柄部）轉動，繼而引起結合于“轉子”另一端的頭部F1因子發生一定的構象變化，結果使ADP與Pi合成ATP分子，并被釋放出來。◆ATP合成酶作用的“結合變構機制”假說ATP合成酶作用機制：H+F0F1H+流H+流H+流γ亞基與β亞基接觸，使β亞基轉變成開放型構象。γ亞基完整旋轉一周，使每個β亞基都經歷3種不同的構象改變，導致3個ATP生成并從酶表面釋放。ATP合成酶中使電化學能轉換成機械能的效率幾乎達到100%，是迄今發現的自然界最小的“分子馬達”。Loose,疏松型：無活性，可與ADP和Pi底物疏松結合Tight,緊密型：有ATP合成活性，可緊密結合ATPOpen,開放型：無活性，與ATP親和力低。ATP酶復合體合成ATP的結合變構機制TheNobelPrizeinChemistry1997wasawardedtoPauld.Boyer三、線粒體的半自主性與起源半自主性細胞器（semiautonomousorganelle）：線粒體具有自己的DNA（mitochondrionDNA，mtDNA）以及復制、轉錄、翻譯、加工的一套裝置，因而具有獨立編碼、合成蛋白質的能力；但是它只編碼少量線粒體蛋白質，大部分蛋白質還是由核DNA編碼并在細胞質核糖體合成后再運送到線粒體的；并且線粒體基因的復制與表達所需的許多酶也是由核DNA編碼的，受核遺傳系統的指導和控制，所以線粒體的遺傳系統是半自主性的。1、mtDNA形狀、數量、大小◆雙鏈環狀（除綠藻mtDNA，草履蟲mtDNA）。◆mtDNA大小在動物中變化不大，但在植物中變化較大，高等植物中約為200kb~2500kb。線粒體DNA（mtDNA）人類基因組含有大約20000到25000個基因。水稻基因組大約含有38000個基因，是人類的1.7倍。◆人mtDNA：16,569bp，37個基因（編碼12S、16SrRNA；22種tRNA；13種多肽：NADH脫氫酶7個亞基，cytb-c1復合物中1個cytb，細胞色素C氧化酶3個亞基，ATP合成酶2個F0亞基）。H鏈編碼12種多肽鏈和14種tRNA和12srRNA和16srRNA；L鏈僅編碼1種多肽鏈和8種tRNA

。人mtDNA是一個雙鏈閉合環狀分子，外環含G較多，稱重鏈(H鏈)，內環含C較多，稱輕鏈(L鏈)。2、mtDNA復制方式●以半保留方式進行自我復制。3、mtDNA復制與細胞周期●mtDNA復制的時間主要在細胞周期的S期及G2期；DNA先復制，隨后線粒體分裂。●復制仍受核控制。線粒體的增殖與起源線粒體的增殖由原來的線粒體分裂或出芽而來。●內共生學說（endosymbiosishypothesis)●非共生學說線粒體的起源內共生起源學說線粒體的祖先——原線粒體是一種革蘭氏陰性細菌。

當這種細菌被原始真核細胞吞噬后，即與宿主細胞間形成互利的共生關系：原始真核細胞利用這種細菌獲得更充分的能量，而這種細菌則從宿主細胞獲得更適宜的生存環境。在長期進化過程中，共生細菌的大部分遺傳信息轉移到細胞核上，而留在線粒體內的遺傳信息大大減少。（Margulis，1970）（1）內共生起源學說的主要內容◆基因組在大小、形態和結構方面與細菌相似。◆有自己完整的蛋白質合成系統，能獨立合成蛋白質，蛋白質合成機制有很多類似細菌而不同于真核生物。（2）內共生起源學說的主要論據基因排列緊密mtDNA沒有內含子，排列緊密；mtDNA上基因缺少非翻譯區，很多基因沒有完整的終止密碼，僅以T或TA結尾；兩條鏈都有編碼功能；具有基因重疊現象。tRNA的種類不同tRNA兼用性也較強，僅用22個tRNA來識別多達48個密碼子；而核內有30多種與氨基酸對應的tRNA。遺傳密碼和通用密碼不同

密碼子“通用”密碼線粒體密碼UGA終止密碼色氨酸AUA異亮氨酸甲硫氨酸AGA精氨酸終止密碼AGG精氨酸終止密碼

◆兩層被膜有不同的進化來源，外膜與細胞的內膜系統相似，內膜與細菌質膜相似。◆以分裂的方式進行繁殖，與細菌的繁殖方式相同。◆能在異源細胞內長期生存，說明線粒體具有的自主性與共生性的特征。◆線粒體的祖先很可能來自反硝化副球菌或紫色非硫光合細菌。（2）內共生起源學說的主要論據（續）四、線粒體病（mitochondrialdisease）線粒體病：指線粒體功能障礙或異常所引起的疾病，已知的人類線粒體病有100多種。線粒體病有以下共同特征：1）主要侵犯代謝旺盛、需要能量高的組織、器官，如肌肉、心臟、大腦。2）異質性（heteroplasmy）：每個細胞含有很多個mtDNA，并非一個細胞中所有的mtDNA都發生突變，因此細胞中的mtDNA存在突變型與野生型兩種類型，即異質性。只有當突變的mtDNA逐漸積累，其比例達到一定閾值（threshhold）才能引起疾病。母系遺傳（maternalinheritance)3）家族性：人類的mtDNA為母系遺傳(maternalinheritance)，mtDNA突變導致的線粒體病呈單純的母系遺傳。人精子細胞中約25個線粒體精子細胞尾部環狀線粒體mtDNA點突變與疾病Leber遺傳性視神經病（ＬＨＯＮ）：Leber′shereditaryopticneuropathy以德國眼科醫師TheodorLeber的姓氏命名

雙胞胎兄弟患者視乳頭盤血管膨脹，視神經萎縮視神經壞死雙側中央視力喪失視乳頭毛細血管擴張性微血管病視盤周圍神經纖維層膨脹發病：18-30歲11778G→A導致編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第340位的Arg→His，從而影響線粒體能量的產生。大約50%的LHON病例由該位點突變引起。

11778G→ALHON與LHON病相關的mtDNA突變mtDNA突變相關基因nt.11778G→AND4nt.15257G→ACybnt.3460G→AND1

nt.4160T→CND1

nt.14484T→CND6nt.7444G→ACOI1.11778G→A,喪失了ＳfaNI酶切位點LHON的基因診斷１２３４５６