第九章凝膠過濾及離子交換層析介質廣東省韶關學院生物科學系

第一節概述自茨維特1903年發明色譜法以來，該方法已經廣泛用于生物分子的分析分離與制備。在蛋白質、多糖、天然產物的分離純化與除熱源等方面得到了廣泛的應用。其中的填料——色譜介質，是決定色譜分離效果的主要、最重要的因素。目前，各個國家的許多公司，均有專門的色譜出售。有的用于分析效果好，有的適合大規模制備使用。60年代末，70年代初，高效液相色譜儀的研制成功，使色譜實現機械化、自動化操作，提高了操作的復現性。這類全自動的生產規模級的層析系統（如瑞典Pharmaciacom.的BioprocessⅠ、），能高速處理大量樣品，流速從4-20L/h到40-400L/h，能滿足各類規模生產的需要。他們的填料特點是：1、適用于實驗室和大規模生產，重現性高。2、易清洗、消毒和再生，理化性質穩定，使用壽命長。3、易裝柱，高工作容量，高流速，利于工業化生產。1975年Small提出了離子交換色譜法，1981年Jorgenson創立了毛細管電泳法。20世紀90年代后，出現的擴張床吸附技術，通過一步純化，達到萃取、濃縮和初步純化的目的，所用的填料是STREAMLINE介質——一種以Sepharose為基架的介質。2004年GEHealthcare(原安瑪西亞公司)推出的新一代EBA擴張柱STREAMLINEDirect柱，消除了樣品和氣泡容易堵在篩網下的問題。各種用于大規模大分子分離純化生產的色譜方法見表9-1，需注意他們的分離原理、特點和應用。類型機理優點缺點適用范圍離子交換靜電吸附操作簡便，分辨率高，流速快，容量高易受離子干擾大量樣品處理凝膠過濾分子大小排阻效應分辨力中等，不會引起變性，流速低，容量有限各種凝膠介質昂貴，處理量有限制適合脫鹽，去熱源和純化的最后步驟疏水色譜疏水性分辨力高，重復性較好，體積不受限影響因子多適合純花的各個階段親和色譜生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高，流速快，容量大，體積不受限一種配體只能用于一種生物大分子適合純花的各個階段聚焦色譜等電點和離子交換作用分辨力高，流速快，容量大進口試劑昂貴純化的后階段第二節凝膠過濾介質一、凝膠過濾概念：又稱排阻層析或分子篩方法，是利用凝膠網狀結構，根據分子的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化的方法。凝膠過濾的優點：①介質穩定，不帶電，不與溶質反應，蛋白質不易變性。②適應面廣，對各種大小的分子均適用。③設備簡單，易操作，耗時少，可連續操作。常用于脫鹽和分級分離。分級分離是將分子大小相近的物質分開，且要選擇合適的凝膠，單次上樣量小，一般為床柱體積的5%-10%。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開二、凝膠介質應具備的條件優良的凝膠介質是獲得良好分離效果的前提，介質必須：1、惰性材質，不與溶質和溶劑反應。2、沒有或極少的非特異性吸附，提高回收率。消除帶電基團。3、介質內孔徑大小分布均勻，孔徑分布要窄，才能保證分離效果好。4、凝膠珠大小均勻，均一性好。細粒填料能提高柱效。5、機械強度高，易于消毒，能反顧使用。三、凝膠介質的種類主要為人工合成大分子和天然多糖類1、多糖類骨架這類多糖有纖維素、葡聚糖和瓊脂糖這類介質生物相容性好，親水性強，不會導致生物分子變性失活。由瓊脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代復合凝膠——Superdex高效過濾介質，使生產效率進一步提高，從小規模過濾延伸到大規模生產。2、合成大分子骨架介質這類介質有聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇系和含羥甲基酰胺類等。克服了天然介質易受微生物侵蝕的缺點，保留了多糖骨架親水的優點。3、天然大分子與合成高聚物構成混合骨架的介質既親水抗微生物侵蝕，又有很好的生物相容性和剛性。凝膠層析分類

分類原則類型特征據溶質分子與固定相相互作用的機理不同吸附色譜離子交換色譜疏水作用層金屬螯合色譜共價作用色譜分配色譜凝膠過濾親和色譜吸附力不同各物質與固定相之間的離子交換能力的不同各物質與固定相之間的疏水作用的強弱不同各物質與固定相上的金屬離子的絡合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同各物質在兩液相間的分配系數不同各物質的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同據實驗技術

低壓色譜中壓色譜高壓色譜電泳操作壓力小于0.5MPa操作壓力在0.5～5MPa之間操作壓力在5～40MPa之間溶質分子在電場中的移動速度不同據固定相的形狀不同柱色譜紙色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層據流動相的物態不同

氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜流動相為氣體流動相為液態流動相為液態按操作方式不同

迎頭法頂替法洗脫法將混合物溶液連續通過固定相，只有化學親和力最弱的組分以純粹狀態最先流出，但其它各組分都不能達到分離。利用一種化學親和力比各被結合組分都強的物質來洗脫，這種物質稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。系列名稱

分離范圍

顆粒大小

應用

Superdexprepgrade系列

Superdex30PG

小于10000

24~44微米

小肽

Superdex75PG

3000~70000

24~44微米

一般蛋白

Superdex200PG

10000~600000

24~44微米

單抗、大分子蛋白

Superose系列

Superose6PG

5000~5000000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸、病毒

Superose12PG

1000~300000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸

SephacrylHR系列

SephacrylS-100

1000~10000

25-75微米

肽類、小蛋白

SephacrylS-200

5000~250000

25-75微米

一般蛋白

SephacrylS-300

10000~1500000

25-75微米

抗體等較大蛋白

SephacrylS-400

~28000000

25-75微米

多糖、蛋白多糖、脂質體

SephacrylS-500

~60000000

25-75微米

<1078bp的DNA片斷

SephacrylS-1000

~100000000

40-105微米

<20000bp的質粒、巨大多糖、病毒

SepharoseFF系列

Sepharose6FF

10000~4000000

45~165微米

質粒、病毒

Sepharose4FF

60000~20000000

45~165微米

病毒，rHBsAg等巨大分子

Sepharose

xB（CL-xB）系列

Sepharose2B

70000~40000000

60-200微米

大分子復合物

Sepharose4B

60000~20000000

45-165微米

病毒等大分子

Sepharose6B

10000~4000000

45-165微米

大分子SephadexLH系列

SephadexLH20

100-4000

30-100微米

天然產物

SephadexLH60

400-20000

40-120微米

天然產物

Sephadex系列

SephadexG-10

小于700

40-120

SephadexG-15

小于1500

40-120

SephadexG-25coarse

1000-5000

100-300

脫鹽及更換緩沖液用

SephadexG-25medium

1000-5000

50-150

SephadexG-25fine

1000-5000

20-80

SephadexG-25superfine

1000-5000

10-40

SephadexG-50coarse

1500-30000

100-300

小蛋白、多肽的分離

SephadexG-50medium

1500-30000

50-150

SephadexG-50fine

1500-30000

20-80

SephadexG-50superfine

1500-30000

10-40

SephadexG-75

3000-80000

40-120

一般蛋白的分離

SephadexG-75superfine

3000-70000

10-40

SephadexG-100

4000-150000

40-120

較大蛋白的分離SephadexG-100superfine

4000-100000

10-40SephadexG-150

5000-300000

40-120

大蛋白的分離SephadexG-150superfine

5000-150000

10-40SephadexG-200

5000-600000

40-120

大蛋白的分離SephadexG-200superfine

5000-250000

10-40

四、凝膠過濾注意事項凝膠過濾常用于下游產品最終純化步驟。填料選擇：根據樣品中組分情況，選擇分離范圍與分子量相近的介質。組分多，大小分布廣的樣品應選分離范圍廣的介質；成分簡單的樣品選擇分辨率高的凝膠。如需處理大量樣品，要選擇粒度較大，流速較快的介質，要精細分離的，選粒度小分辨率高的介質。裝柱：均勻攪拌一次倒入柱中，不能有氣泡和分層。為確保柱效，可用1%丙酮、蘭色葡聚糖等測定柱效。加樣：不能沖動凝膠表層，每次控制樣品5%V。體積小分辨率高。為減少非特異性吸附，可在緩沖液中加一定濃度的鹽，0.1-0.2MNaCl。第三節凝膠過濾介質的主要品種一、葡聚糖系列Sephadex1、結構以氯代環氧丙烷進行交聯的葡聚糖珠狀凝膠，孔徑大小取決交聯度。按孔徑不同形成G系列凝膠。葡聚糖結構G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數字既代表交聯度，也代表持水量。X數字越小，交聯度越大，網孔越小，適用于分離低分子質量生化產品。X數字越大，交聯度越小，網孔越大，適用于分離高分子生化產品。X數字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。2、性能①溶脹性能吸水膨脹，商品以干粉供應。②化學穩定性不溶于一切溶劑，在水、鹽、堿和弱酸中穩定。③物理穩定性pH近中性時耐高壓高溫，所以可以高壓滅菌。④機械強度各種G系列凝膠均有一定機械強度，能承受一定壓力，機械強度大小取決于交聯度。3、主要用途小孔徑凝膠用于脫鹽與小分子分離，大孔徑凝膠用于蛋白質、核酸等大分子分離。4、衍生物葡聚糖結構中引入-CH2-OH（羥丙基）即成為LH系列凝膠。引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-SephadexA）等。用途更廣，可用于脂類，激素和維生素等小分子分離，也適用于有機溶劑和極性有機溶劑緩沖液。LH系列的用途：①用于有有機溶劑的凝膠過濾②結合了凝膠過濾、分配色譜和吸附層析的特點，適用于其他凝膠難處里的樣品，能分離結構非常相似的分子。③排阻極性與母體凝膠相同。④高負載長壽命，高分辨率，可載樣300mg/ggel。（書本P167列出了它們的性能參數）二、瓊脂糖系列瓊脂糖凝膠（agarosegel）由經過純化瓊脂糖制備的。可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區間擴大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達相對分子質量108，但是由于瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團，其結構為：β-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區間，又沒有吸附作用。但其穩定性遠不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強酸強堿能引起結構破壞。最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠。它的商品名因生產廠家不同而異。

瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號，即Sepharose2B，4B和6B（同中國相同）。阿拉伯數字表示凝膠中干膠的百分含量。

美國的為Bio－GA，有6個型號，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯數字乘以106表示排阻限度。英國的稱為Sagavac，又分為Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯數字表示凝膠中干膠的百分數，F代表粉末狀，C代表顆粒狀。丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2％，4％，6%，8％和10％；百分數表示干膠量。瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復原有形狀，因此商品大都以含水狀態供應，并應在濕態保存。一般懸浮在l0-3mol/LEDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。1、Bio-gelA系列Bio-rad公司產，pH適應范圍廣，4-13均有效。具體參數見表9-4（P168）2、Sepharose是應用最廣，型號最多系列。性能見書P169表9-5。1）、Sepharose

最早的產品，為非交聯結構。需在2-40℃使用，漸被淘汰。2）、SepharoseCL是瓊脂糖珠體與2，3-二溴丙醇交聯而成，經堿水解除去硫酸根，減少了非特異性吸附。可120℃高壓，也能用作離子交換劑和吸附劑。3）、Superose

珠狀瓊脂糖2次交聯制備的。提高了產品的剛性，增強了理化穩定性。分離范圍更廣，分辨率更高。顆粒細小，剛性強粒度均勻，柱效高，可容許高流速，適用于中、高速層析系統。用于糖、核酸、病毒、變性劑中的蛋白質純化。4）、SepharoseFastFlow高度交聯的瓊脂糖凝膠，高機械強度，高流速。性質穩定，非特異性吸附低，產物回收率高。三、聚丙烯酰胺系列聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺通過自由基引發聚會形成聚丙烯酰胺凝膠。控制單體用量和交聯劑的比例，就能得到不同型號（孔徑）的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的結構

在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯劑的配比可以任意改變。以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯劑總克數，稱為凝膠濃度。而其中交聯劑占單體和交聯劑總量的百分比稱為交聯度，以（C）表示，交聯度越大，網孔越小，交聯度越小，則網孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構成，穩定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，故一般只在pH2～11的范圍內使用。商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動溶脹成膠。聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯數字表示，從Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯數字乘以1000即相當于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。目前，美國Bio-RadLaboratories生產并出售多種規格的Bio-GelP。四、Sephacryl

系列由烯丙基葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺聚合交聯而成。易裝柱，流速高，分辨率高，穩定。樣品體積適應廣，從幾um到幾千L均能用。五、Superdex

系列最新的凝膠介質，由葡聚糖以共價方式與高交聯的瓊脂糖珠結合形成的符合凝膠。剛性強分辨率高，pH適應性廣，產物回收率高，性質穩定。六、聚乙烯醇系列聚乙烯醇系列Toyopearl以交聯聚乙烯醇為骨架構成的凝膠介質，產生于1980 s年代。多孔的三維網狀結構，大分子鏈上含許多-OH基團，親水性強，與生物分子相容性好，常作為固定化酶的載體。七、Bio-BeadsS-X系列以多孔苯乙烯和二乙烯苯交聯形成的共聚物，適用于疏水性物質和非水體系，以此為母基構成相應的離子交換劑。具體性能見書P172，表9-10。第四節離子交換法及離子交換劑的選擇一、離子交換法離子交換法是通過帶電的溶質分子與離子交換劑可交換的離子進行交換，達到分離純化的技術方法。主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離。該方法具有分辨率高、工作容量大、易于操作的特點。在生化分離中75%的工藝采用了離子交換法。選擇適當條件可使一些溶質分子變成離子態，通過靜電作用結合到離子交換劑上，而另一些物質不能被交換，這兩種物質就可被分離。帶同種電荷的不同離子雖都可以結合到同一介質上，但由于帶電量不同，與介質的結合牢度不同，改變洗脫條件可依次被洗脫而達到分離的目的。離子交換劑是一類能顯示離子交換的功能高分子材料。分為無機離子交換劑和有機離子交換劑。無機離子交換劑有機離子交換劑沸石、磺化煤離子交換樹脂離子交換長期以來應用于水處理和金屬的回收。在生物工業中，由于離子交換法分辨率高、工作容量大且易于操作，幾乎所有的生物分子都是極性的，都可使其帶電，所以離子交換法已廣泛用于生物分子的分離純化技術。主要應用在抗生素、氨基酸、有機酸等小分子的提取分離。近年來在蛋白質等生物大分子的分離提取也有應用。離子交換樹脂的出現已有近80年的歷史.離子交換樹脂發展史上的3個重要階段1933年Adams和Hofms發明了縮聚類酚醛型陽、陰離子交換樹脂,二戰及二戰后期離子交換樹脂大發展

1939年德國法本公司和1941年美國的樹脂產品和化學品公司先后開始工業生產，在第二次世界大戰中，美國獲得了苯乙烯系和丙烯酸系加聚型離子交換樹脂合成的專利。它開創了當今離子交換樹脂制造方法的基礎。離子交換樹脂的發展50年代以后，開展了膜狀離子交換樹脂的研究,開辟了電化學的新領域。50年代末，60年代初期,又研制出耐壓、耐磨、高交換速度、能交換或吸著高分子量化合物的大孔離子交換樹脂。70年代以后，出現了各種大孔吸附樹脂及特種樹脂。

我國在1950年以后開始離子交換樹脂的研究，

1956年何炳林提出并合成了大孔型離子交換樹脂

1958年，離子交換樹脂在國內正式投入工業化生

其結構由三部分組成：1.不溶性的三維空間網狀結構構成的樹脂骨架，使樹脂具有化學穩定性和機械強度；2.是與骨架相聯的功能基團；3.是與功能基團帶相反電荷的可移動的離子，稱為活性離子，它在樹脂骨架中的進進出出，就發生離子交換現象。功能基團與可交換離子所帶電荷相反，以靜電作用，可進行交換的離子稱為反離子或抗衡離子。反離子可與溶液中同種電荷離子進行交換，交換反應可逆，故離子交換劑和反復使用。操作方式有2種，1為正吸附，即將目的產物離子化吸附到介質上，雜質不被吸附而從柱中流出；產物純度高切被濃縮，適用于產物濃度低的且液體量大的溶液。2為反吸附，就是將雜質吸附到介質上，產物不被吸附而從柱中流出；所得產物純度不高，適用于產物濃度高的溶液。操作方法有間歇式分批操作和柱式操作2種。間歇式分批操作又稱靜態處理，是將離子交換劑浸泡在工作液內，達到平衡后濾出介質進行洗脫。柱式操作也稱動態法，交換、洗滌、再生均在離子交換柱內進行，也叫離子交換色譜法。二、生化用離子交換劑的特點1、親水性和生物相容性離子交換劑均具有較好的親水性和生物相容性，骨架則有的親水有的疏水，親水的在水中可溶脹成水溶膠，不與生物分子反應。2、孔結構介質孔穴有3種，①凝膠孔，經交聯大分子鏈間成孔，干態時柱體內無孔隙，②大孔樹脂介質孔，在有機溶劑存在時進行聚合，干濕狀態下均存在，最大直徑達2.5×104-5×104nm。③瓊脂糖介質孔，大小隨瓊脂糖濃度而定。這種介質兼顧分子篩和離子交換作用。3、電荷密度生物大分子常有多個帶電點，能與多個功能基結合。這種多點結合與無機物（1︰1）結合不同，結合更牢，不易洗脫，造成不可逆吸附，故電荷密度適度才有利生物大分子分離，而不是密度越大越好。4、粒度粒度越小，分布越均勻，分離效果越好。粒徑越小，交換速度越快，因生物分子在珠內路徑越短。5、純度①工業級用于純度不高用量很大的工藝過程。②分析級經有機溶劑、螯合劑和高純度酸堿處理后的介質。用于分析實驗。③生物技術級粒徑小，分布均，適用一般生化分離和去離子操作。④分子生物級也叫無DNA級不存在核酸內切酶、外切酶及連接酶抑制劑。三、生物大分子離子交換的機理與交換劑的選擇1、蛋白質帶電性決定對交換劑的選擇（陽/陰離子交換劑），蛋白質帶電性決定于溶液pH值。2、離子交換劑強弱對酸性/陽離子交換劑，pK越小酸性越強；堿性/陰離子交換劑，pK越大堿性越強。低pH（<3）時應選擇強酸性介質，高pH（>10）時應選擇強堿性介質；電荷密度特別高的分子應采用弱離子交換劑，以避免不可逆吸附。3、螯合分離介質選擇含螯合基團，能與金屬離子螯合的分離介質即螯合分離介質。使用于含金屬離子的蛋白質或除去產品中的金屬雜質。4、選擇適宜工作條件，提高工作容量全交換容量每克干介質/每毫升濕介質所具有的功能基的含量。工作容量每克干介質/每毫升濕介質在一定操作條件下交換吸附蛋白的實際容量，也叫有效容量或動力學容量。受溶液種類、pH、流速及雜質等影響的可變參數。可見，功能基的多少決定交換能力的大小，功能基種類決定其電性能。四、離子交換分離介質使用應注意的問題1、預處理酸、堿或有機溶劑，使之轉變成所需的離子型2、裝柱均勻無氣泡和分層。3、流速影響吸附、洗脫效果，洗脫以慢速較好。4、適當的洗脫與再生方式將顆粒內、外表面吸附的分子解吸下來。由于溶液中不止一種蛋白，故常改變洗脫條件洗脫。5、消毒與樹脂復蘇高品質生物制品要求對分離介質消毒，除去微生物等混入其中。對交換容量下降的介質則進行復蘇，恢復交換能力。清除介質中的“毒素”，使其恢復工作能力的過程就是復蘇。第五節離子交換劑的種類生化分離型介質按介質骨架分有天然多糖骨架和人工合成/半合成的介質。目前國際上有100多個有關介質品牌和品種。80%用于水處理。一、通用型離子交換樹脂功能基種類能用于水處理、濕法冶金、化學合成和醫藥工業等用途廣泛的離子交換樹脂叫通用型樹脂。強/弱酸性、強/弱堿性、螯合型；凝膠型、大孔型；按合成的單體分有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系等。參考書P178表9-12二、通用型樹脂常用牌號用于從發酵液中分離有機酸、抗生素、氨基酸和天然產物提取等。見書P179表9-13和9-14。三、生化專用離子交換劑主要用于生化領域，其他領域使用很少，粒度較小的分離介質。目前還是以多糖類骨架為主，一般