實驗五、DNA的體外連接學習DNA片段之間的體外連接方法一、實驗目的二、實驗原理DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段5’端磷酸和3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶主要有：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌連接酶兩種。T4DNA連接酶的底物可為：(1)一條鏈帶有缺口的雙鏈DNA分子；(2)兩個存在互補粘性末端的雙鏈DNA片段；(3)兩個存在平末端的DNA片段；(4)RNA－DNA雜合體中，具缺口的RNA和DNA分子。T4DNA連接酶催化DNA連接的反應分三步進行：(1)輔助因子ATP中磷酸基團與T4DNA連接酶上的Leu殘基的NH2結合，形成酶-AMP復合物；(2)酶-AMP復合物活化DNA鏈5’端的磷酸基團，形成磷酸－磷酸酯鍵；(3)DNA鏈3’端的羥基活化與5’端磷酸根形成磷酸二酯鍵，釋放AMP，完成DNA鏈間的連接。用于克隆的質粒載體在用單酶切酶切成線狀后，一般需用堿性磷酸酯酶(CIP或BAP)進行去磷酸化處理，以防止載體自身環化，減少不含重組子的菌落產生。四、儀器設備五、實驗用具電泳儀

微型電泳槽

紫外透射檢測儀

恒溫金屬浴冰箱冰盒微量離心管移液器微量離心管（1.5ml、0.5ml）

吸管頭若干三、實驗材料上次實驗課回收的MP3酶切片段，用試劑盒抽提的pSK質粒六、試劑

瓊脂糖0.5TBE電泳緩沖液

10載樣緩沖液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色劑（10000，Solarbio）DNA分子量標準（DNAmarker）：MarkerIII（廣州東盛生物科技有限公司）已知系列濃度的λDNA(10、20、50、100ng/l)（TaKaRa）牛小腸堿性磷酸酶（calfintestinealkalinephosphatase,CIAP,TaKaRa）T4DNA連接酶（T4DNAligase,TaKaRa）DNA凝膠回收試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）七、實驗步驟1、pSK載體的HindIII酶切2、HindIII酶切pSK載體的脫磷3、脫磷pSK載體的回收4、目的片段和載體的定量5、目的片段和載體的連接6、準備感受態細胞制備和大腸桿菌轉化用試劑和用品1、pSK載體的HindIII酶切100l反應體系（1.5ml離心管）：

pSK質粒DNA

500ng（試劑盒抽提）酶切Buffer

10

l

Hind

III酶1

l滅菌ddH2O

upto

100l加樣順序：水、buffer、DNA、酶37℃恒溫箱酶切30min。

2、HindIII酶切pSK載體的脫磷在上述100l酶切體系中加入：

10×CIAPbuffer

5l

稀釋10倍的CIAP酶1l（3U）37℃恒溫箱消化30min。注：濃度高的酶可以用水和反應buffer進行稀釋，稀釋后的酶液應在1×的buffer里；稀釋的酶先用現配，用后棄去。100l稀釋體系（1.5ml離心管）：滅菌ddH2O

80lCIAPBuffer

10

l

CIAP酶10

l加樣順序：水、buffer、酶，輕柔混勻后短暫離心收集到管底備用。3、脫磷pSK載體的回收在上述脫磷體系中加入ddH2O調整體積到200l，然后加入等體積的BD溶液，然后利用DNA凝膠回收試劑盒從步驟5開始進行回收，最后用30l的Eluent進行洗脫。利用瓊脂糖凝膠（1%）電泳法檢測DNA濃度：分別取回收的MP3酶切片段、酶切和脫磷的pSK質粒、已知濃度的λDNA各1l于點樣板小孔中，再加入8lTE和1l的10載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。同時點5lMarkerⅢ作為分子量標準。電泳后的目的片段和載體條帶的亮度與已知濃度的λDNA的亮度進行比較，估算出其濃度。4、目的片段和載體的瓊脂糖凝膠電泳定量4、目的片段和pSK載體的連接（每組同時做2個載體自連對照）10l反應體系（0.5ml離心管）：酶切的pSK質粒DNA

10-20ngMP3酶切回收片段10-20ng10×T4DNA連接酶Buffer

1

l稀釋10倍的T4DNA連接酶1

l（35U）滅菌ddH2O

upto

10lddH2O、pSK質粒DNA和MP3酶切片段混勻后先在45度熱板上溫育5min使粘性末端分開，之后加入T4DNA連接酶buffer和T4DNA連接酶，混勻，稍離心后放于4℃冰箱中連接到下次實驗。T4DNA連接酶Weiss單位：連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現在也稱為ppi單位。0.01個Weiss單位能在16℃，30min內將HindIII完全酶切的1ug

DNA片段完全連接。（粘性末端）1個Weiss單位在16℃，30min內能將HaeIII完全酶切的1ug

DNA片段完全連接。（平末端）DNA分子連接帶有相同粘性末端的載體和外源DNA片段，在連接反應中外源片段和載體DNA均可發生自身環化或幾個分子串聯形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都有可能。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度，以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA的5’-磷酸基團用堿性磷酸酶去掉，最大限度的抑制質粒DNA的自身環化。帶5’端磷酸的外源DNA片段可以有效的與去磷酸化的載體相連，產生一個帶有兩個缺口的開環分子，在轉入大腸桿菌受體菌后的擴增過程中，缺口可自動修復。注意事項1、克隆用的載體質粒要求較高純度，使之能用最少的酶和較短的反應時間達到完全的切斷。使用過量的內切酶或CIP以及過長時間的反應會使載體末端缺失，產生大量的假陽性菌落（白色但沒有插入子）。2、使用T4DNA連接酶之前，應看清楚生產廠家所使用的活性定義單位，以便采用合適的酶濃度反應條件，不致造成不必要的浪費。3、目的DNA片段與載體DNA之間的摩爾濃度